Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
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著者らは、この研究で使用されたscAAV8-GFPベクターを提供してくれたノースカロライナ大学のベクターコア、CGIBD組織学コア、およびこの研究の臨床評価の側面を支援してくれたブライアンC.ギルガー博士の研究室に感謝します。この研究は、ファイザー-NC Biotech特別ポスドクフェローシップと、American Society of Gene & Cell TherapyおよびCystic Fibrosis Foundationのキャリア開発賞の支援を受けました。内容は著者の責任であり、必ずしもAmerican Society of Gene & Cell TherapyまたはCystic Fibrosis Foundationの公式見解を表すものではありません。

すべての動物の手順は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の施設動物管理および使用委員会の規則に従って実行されました。AAVベクターの使用は、バイオセーフティレベル1のバイオハザードリスクです。AAVを取り扱うときは、白衣、手袋、ゴーグルなどの適切な個人用保護具を着用してください。本明細書に記載の実験のために、血清型8キャプシドをパッケージ化し、緑色蛍光タンパ?...

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	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

AAVを介した遺伝子治療は、眼疾患の治療に大きな可能性を秘めています。現在の眼科遺伝子治療は、硝子体内注射と網膜下注射の2つの主要な局所投与経路に依存しています。残念ながら、どちらの経路も侵襲的であり、網膜剥離、白内障形成、眼内炎などの重篤な合併症を引き起こす可能性があります。したがって、SCJ注射などの比較的侵襲性の低い経路の調査は非常に興味深いものです。...

眼疾患は、遺伝性疾患と後天性疾患の両方の広い範囲を網羅しています。2015年には、世界中で推定3,600万人が法的に失明し、10億人以上が少なくともある程度の視覚障害に苦しんでおり、すべてのレベルで緩和の取り組みを拡大する必要性が浮き彫りになりました1。眼薬を送達するための主な方法には、点眼薬または結膜下注射(SCJ)、皮内注射、硝子体内注射、および網膜下注射などの局所投与と局所投与の両方が含まれます。非侵襲的局所療法は眼科用薬物の最も一般的な送達方法であり、多くの前眼部障害に広く使用されていますが、角膜の解剖学的障壁の存在は、局所投与された物質のバイオアベイラビリティ、生体分布、および有効性に課題を提示し、それが多くの内眼疾患の最良の候補治療経路ではない可能性があることを示唆しています。疾患の影響を受ける特定の眼コンパートメントへの局所注射は、より効果的で標的を絞った薬物送達アプローチである可能性があります2。ただし、繰り返しの注射に起因する副作用は、投与戦略を複雑にする可能性があります。.理想的には、治療は単回投与後に長期的な治療効果を維持する必要があります。.したがって、遺伝子治療は、必要な注射の回数を最小限に抑え、眼疾患の治療のための持続的な導入遺伝子発現を提供するための有望な選択肢である3,4。
多数のウイルスおよび非ウイルスベクターが遺伝子治療に利用可能です。ただし、AAVベクターは、その優れた安全性プロファイルのために高い関心を集めています。AAVは、1965年にAtchisonらによってアデノウイルス製剤の汚染物質として最初に発見された小さな一本鎖非エンベロープDNAウイルスです5,6AAVは、その後1980年代に遺伝子送達のための効率的なウイルスベクターとして設計され、眼疾患を含む多くの疾患に最適な遺伝子治療ベクターになりました。 過去数十年にわたって。これらの中で最も注目に値するのは、まれな後眼疾患であるレーバー先天性アマウロシスを治療するために米国食品医薬品局によって承認された最初の市販の遺伝子治療薬であるボレチゲンネパルボベックです。ボレチゲンネパルボベックは臨床開発の障壁をうまく克服しましたが、追加の眼遺伝子治療の商業化には課題が残っています。例えば、ボレチゲンネパルボベックは、網膜下注射を介して生存可能な網膜細胞を保持する患者に投与される。したがって、生存可能な網膜細胞を欠くより進行した形態の疾患を有する患者は、臨床的利益をもたらさないため、治療の資格がない。さらに、眼の炎症、白内障、網膜裂傷、黄斑症、および疼痛を含む、網膜下注射手順に関連する既知の合併症が観察された7,8。この手順に関連する他の懸念には、出血、網膜剥離、眼内炎、および眼組織の破壊による眼免疫特権状態の取り消しの可能性が含まれます9,10,11,12。したがって、SCJ注射などの侵襲性の低い遺伝子送達経路を探索する努力はますます重要になっている13、14、15、16、17。
結膜は、3〜5層の細胞を含み、前眼を内眼瞼に接続する薄い膜です。SCJ注射は、加齢黄斑変性症、緑内障、網膜炎、後部ブドウ膜炎などの眼疾患の治療のために、眼の前部および/または後部の両方への眼科用薬物送達に臨床的に使用されます18,19。それらは比較的簡単に実行でき、外来患者の設定20での眼科用薬物送達に日常的に使用され、やや痛みがなく、眼の免疫特権を損なうことはなく、投与された薬物が視神経を含む大きな眼窩周囲領域に広がることを可能にします。したがって、SCJ注射はAAV遺伝子治療アプリケーションにとって魅力的な投与経路です。マウスにSCJ注射を介して投与された天然のAAV血清型は、安全性、形質導入効率、血清免疫原性、生体分布、および組織特異性について以前に特徴付けられています13、16、21。これらのデータは、SCJ投与による個々の眼組織への遺伝子送達が正式な可能性であることを示した。
この論文では、マウスモデルでAAVベクターを送達するためのSCJ注入のための簡単で適応可能なプロトコルについて説明します。このアプローチの再現性を確保するために、実体顕微鏡、プログラム可能な注入/離脱シリンジポンプ(一貫した正確な注入速度と圧力を可能にする)、およびマイクロインジェクションニードルと組み合わせた気密取り外し可能なシリンジで構成される注入システムについて説明します。このシステムは、小動物の間質内、カメラ内、硝子体内、網膜下注射などの他の眼内投与経路に適応できます。さらに、フルオレセイン色素は、AAV注射部位の可視化を可能にするためにしばしば利用される。投与ルートの主要な実践的なステップ、注射プラットフォームのセットアップ、注射の準備、および直接の経験からのヒントについて詳しく説明します。最後に、所望の組織へのAAV送達を確認するための一般的な検証技術について簡単に説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

眼疾患には、広範囲の遺伝性遺伝性疾患および後天性疾患が含まれ、複数の投与経路を介したアクセスが比較的容易であるため、局所薬物送達の魅力的な標的です。結膜下注射(SCJ)は、簡単で安全であり、通常は外来で行われるため、他の眼内投与経路よりも優れています。小動物へのSCJ注射は、通常、目の大きさのために手術用顕微鏡の支援を必要とする。以前の研究では、特定のアデノ随伴ウイルス(AAV)血清型のSCJ注射が、眼表面、眼の筋肉、角膜、視神経の標的形質導入のための有効な遺伝子送達戦略であり、多くの眼疾患の治療に潜在的なアプローチを提供することが実証されています。
ここでは、プログラム可能な注入/離脱シリンジポンプ(一貫した正確な注入速度と圧力を可能にする)とマイクロインジェクション針と結合された気密取り外し可能なシリンジで構成される注入システムを使用したマウスモデルでのSCJ注射の詳細なプロトコルが提示されます。注射システムは、小動物における間質内、カメラ内、硝子体内、網膜下注射などの他の眼内投与経路にも適応可能である。眼の遺伝子治療研究のためのアデノ随伴ウイルスベクターの送達が記載されているが、本明細書のプロトコルは、小動物モデルにおける様々な眼科溶液にも適合させることができる。投与ルートの主要な実践的なステップ、注射プラットフォームのセットアップ、注射の準備、および直接の経験からのヒントについて詳しく説明します。さらに、所望の組織へのAAV送達確認のための一般的な検証技術についても簡単に説明します。

結膜下腔に注入された溶液は、注入量に応じてブレブとして現れる。 本実験では、フルオレセインと最終濃度0.1%で混合したAAV(7 ×10 9 ウイルスゲノム(vg)/眼)7 μLを実体顕微鏡下で36 G針で注入し、プログラム可能なシリンジポンプを用いて注入速度/圧力を1 μL/sで一定に保ちました。注射時にブレブが現れることがあります(矢印)。マウスSCJ区画へのAAVベクター投与の顕?...

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Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

本稿では、マウスの眼組織に対する有効なベクター送達法として、輸液/離脱シリンジポンプと気密着式シリンジとマイクロインジェクション針を組み合わせた注射システムを用いて結膜下注射を実証しています。この注射システムは、他の眼内投与経路にも適応可能である。

小動物モデルにおけるアデノ随伴ウイルスベクターの結膜下投与

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

このプロトコルは、安全、簡単、効果的な方法で複数の眼組織に遺伝子治療を送達する方法を提供します。また、小動物の間質内および網膜下注射にも適応可能です。結膜下注射経路の使用は最小限の侵襲性である。リスクが少なく、複数の眼疾患を治療するためのAV配信に大きな期待が寄せられています。世界中で10億人以上が視覚障害に苦しんでいるため、安全で簡単な方法で薬物送達を行うことで、さまざまな失明の原因の治療に幅広く適用できます。このプロトコルに記載されている遺伝子送達方法は、潜在的な介入戦略を開発し、最終的にこれらの薬を患者に送達する眼科医を実践している人々にとって特に興味深いものです。このプロトコルを初めて実行する人にとっての最大の課題は、おそらく結膜腔の概念に針を挿入することです。まず、実体顕微鏡とシリンジポンプをバイオセーフティキャビネットに入れて注入システムを組み立てます。次に、ポリエチレンチューブを約50センチの長さにカットします。36ゲージの針の端をチューブの一方の端に挿入します。次に、使い捨ての3ミリリットルシリンジに滅菌水を入れ、針の反対側のチューブの側面に挿入します。滅菌水と70%アルコールを交互に3回洗い流してチューブを消毒し、チューブ全体に漏れ、詰まり、損傷がないことを確認します。使い捨ての3ミリリットルシリンジを使用して、チューブに滅菌水を満たし、チューブを使い捨てシリンジに取り付けたままにします。次に、バイオセーフティキャビネットの表面にパラフォームを置き、それに滅菌水のプールを追加します。針に接続されているチューブの部分を滅菌水のプールに沈めます。次に、使い捨てシリンジをチューブ開口部から引き出して、シリンジを取り外したときにチューブシステムに空気が入らないようにします。次に、10マイクロリットルのハミルトンシリンジに滅菌水を入れます。次に、ハミルトンシリンジの針先をパラフィルム上の滅菌水のプールに沈めて、ハミルトンシリンジ針をチューブの開放端に接続します。ポンプ画面の高速リバースボタンを押したままにして、プッシャーブロックをシリンジのおおよその長さに移動します。次に、ブラケットclを緩めますampノブを緩めて、プッシャーとシリンジホルダーブロックの保持ブラケットを緩めます。その後、ハミルトンシリンジをシリンジホルダーブロックにロードし、製造元の指示に従ってシリンジを固定します。ポンプ設定画面でパラメータを調整するには、フォース」ボタンを押してフォースレベルを30%に設定し、変更を受け入れて設定画面に戻ります。クイックスタート」ボタンを押し、[方法]を選択してから、[注入のみ]オプションを選択します。シリンジオプションについては、ハミルトン1700を選択し、次にガラス「そして10マイクロリットルを選択します。後で、注入速度と注入量を選択します。Infuse」ボタンを押して、チューブと注射針を水でいっぱいにしたまま、ハミルトンシリンジから水を排出します。次に、注射針をウイルスストックのアリコートに入れてウイルスを回収します。次に、リバースボタンを押してハミルトンシリンジを少し引き戻し、チューブに小さな気泡を導入します。動物を麻酔した後、鉗子で結膜をつかみます。次に、ベベルが結膜で完全に覆われるまで針を結膜に挿入し、針を地球に当てます。同時に、フットスイッチを使用してスタートボタンを押して注射を開始します。AAVベクターの分布を調べるために、眼および周辺組織をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。代表的な矢状切片は、インドインクの分散が主に眼周囲の緩い結合組織の強膜の外面の外眼筋に隣接して発生することを示しました。注射後8週間での自己相補的AAV8の形質導入を確認するために、断面中の緑色蛍光タンパク質存在量を免疫蛍光染色により調べた。その結果、AAV8ベクターは眼後方の眼周囲筋と角膜を効率的に形質導入することが明らかになりました。ベクターの生体分布を解析するために、肝臓や心臓を含む他の臓器のベクターゲノムコピー数と明確な眼のコンパートメントを、導入遺伝子に特異的なプライマーとプローブを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって調べました。導入遺伝子の発現は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により確認され、AAV8の結膜下注射により眼瞼、結膜、角膜、視神経に導入遺伝子が発現することが示唆された。気泡は、チューブ内の水と治療薬の間のバリアとして機能します。この技術により、他の研究者は、複数の疾患に対する眼科溶液と眼遺伝子治療の両方に対する結膜下投与経路の使用を探求することができます。

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

医学

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

マウスの長い持続時間の全身温熱療法のためのプロトコル

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

大型動物モデルの絶縁型ワーキングハートシステム

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

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生体内で破壊カルス開発マウス大腿骨の骨、MRI 対応のデバイスを用いたマウスの骨治癒過程の評価

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

小動物陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影における連続的な血液サンプリングにより、動脈入力機能の測定が可能

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...