Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
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저자들은 이 연구에 사용된 scAAV8-GFP 벡터를 제공한 노스캐롤라이나 대학의 벡터 코어, CGIBD 조직학 코어, 이 연구의 임상 평가 측면에 도움을 준 Brian C. Gilger 박사의 실험실에 감사드립니다. 이 연구는 Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship과 American Society of Gene & Cell Therapy 및 Cystic Fibrosis Foundation의 경력 개발 상을 수상했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 American Society of Gene & Cell Therapy 또는 Cystic Fibrosis Foundation의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

모든 동물 절차는 채플 힐에있는 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 규정에 따라 수행되었습니다. AAV 벡터의 사용은 생물안전 레벨 1 생물학적 위험 위험입니다. AAV를 취급할 때는 실험실 코트, 장갑 및 고글을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 본원에 기재된 실험을 위해, 혈청형 8 캡시드로 패키징되고 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 조절하는 일반적인 유비?...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

AAV 매개 유전자 치료는 안구 질환 치료에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 현재의 안구 유전자 치료는 두 가지 주요 국소 투여 경로인 유리체내 및 망막하 주사에 의존합니다. 불행히도 두 경로 모두 침습적이며 망막 박리, 백내장 형성 및 안구내염을 포함한 심각한 합병증을 유발할 수 있습니다. 따라서 SCJ 주사와 같이 상대적으로 덜 침습적 인 경로에 대한 조사는 큰 관심사입니다.
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안구 질환은 광범위한 유전 및 후천성 질환을 포함합니다. 2015년에는 전 세계적으로 약 3,600만 명이 법적으로 시각 장애가 있었고 10억 명이 넘는 사람들이 적어도 일정 수준의 시각 장애를 앓고 있어모든 수준에서 완화 노력을 확대해야 할 필요성이 강조되었습니다1. 안구 약물을 전달하는 주요 방법에는 점안액 또는 결막하 (SCJ), 전방 내, 유리체 내 및 망막 하 주사와 같은 국소 및 국소 투여가 포함됩니다. 비침습적 국소 요법이 안과 약물의 가장 일반적인 전달 방법이며 많은 전방 분절 장애에 광범위하게 사용되지만, 각막 해부학적 장벽의 존재는 국소 투여 물질의 생체 이용률, 생체 분포 및 효능에 대한 도전을 제시하며, 이는 내안의 많은 질병에 대한 최상의 후보 치료 경로가 아닐 수 있음을 시사합니다. 질병의 영향을 받는 특정 안구 구획으로의 국소 주사는 보다 효과적이고 표적화된 약물전달 접근법일 가능성이 높습니다2. 그러나 반복 주사로 인한 부작용은 투여 전략을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이상적으로, 치료는 단일 투여 후 장기적인 치료 효능을 유지해야 합니다. 따라서, 유전자 요법은 필요한 주사의 수를 최소화하고 안구 질환 3,4의 치료를 위한 지속적인 전이유전자 발현을 제공하기 위한 유망한 옵션이다.
수많은 바이러스 및 비바이러스 벡터가 유전자 치료에 사용할 수 있습니다. 그러나 AAV 벡터는 우수한 안전성 프로파일로 인해 높은 관심을 받고 있습니다. AAV는 1965년 Atchison et al.5,6에 의해 아데노바이러스 제제의 오염 물질로 처음 발견된 작은 단일 가닥의 비외피 DNA 바이러스입니다. AAV는 이후 1980년대에 유전자 전달을 위한 효율적인 바이러스 벡터로 설계되었으며 안구 질환을 포함한 많은 질병에 대해 선택되는 유전자 치료 벡터가 되었습니다. 지난 수십 년 동안. 이들 중 가장 주목할만한 것은 희귀 후방 안과 질환 인 Leber의 선천성 Amaurosis를 치료하기 위해 미국 식품의 약국 (FDA)의 승인을 받은 최초의 상업적으로 이용 가능한 유전자 치료 약물 인 voretigene neparvovec입니다. 보레티진 네파보벡이 임상 개발의 장벽을 성공적으로 극복했지만 추가적인 안구 유전자 요법의 상용화에 대한 과제가 남아 있습니다. 예를 들어, voretigene neparvovec은 망막 하 주사를 통해 생존 가능한 망막 세포를 보유하는 환자에게 투여됩니다. 따라서 생존 가능한 망막 세포가 부족한 더 진행된 형태의 질병을 가진 환자는 임상 적 이점을 제공하지 않기 때문에 치료를받을 자격이 없습니다. 또한 눈 염증, 백내장, 망막 파열, 황반 병증 및 통증 7,8을 포함하여 망막 하 주사 절차와 관련된 알려진 합병증이 관찰되었습니다. 이 절차와 관련된 다른 우려 사항으로는 출혈, 망막 박리, 안구 내염 및 안구 조직 파괴를 통한 안구 면역 특권 상태의 취소 가능성이 있습니다 9,10,11,12. 따라서, SCJ 주사와 같은 덜 침습적인 유전자 전달 경로를 탐구하려는 노력이 점점 더 중요해지고 있다 13,14,15,16,17.
결막은 3-5 층의 세포를 포함하고 앞쪽 눈을 내부 눈꺼풀에 연결하는 얇은 막입니다. SCJ 주사는 연령 관련 황반 변성, 녹내장, 망막염 및 후방 포도막염과 같은 안구 질환의 치료를 위해 눈의 전방 및/또는 후방 부분 모두에 안과 약물 전달을 위해 임상적으로 사용됩니다18,19. 이들은 수행하기가 비교적 간단하고, 외래 환자 환경(20)에서 안과 약물 전달을 위해 일상적으로 사용되며, 다소 통증이 없고, 안구 면역 특권을 손상시키지 않으며, 투여된 약물이 시신경을 둘러싸는 넓은 안와 주위 영역을 통해 확산되도록 한다. 따라서 SCJ 주사는 AAV 유전자 치료 응용 분야에 매력적인 투여 경로입니다. 마우스에서 SCJ 주사를 통해 투여된 천연 AAV 혈청형은 이전에 안전성, 형질도입 효율, 혈청 면역원성, 생체분포 및 조직 특이성13,16,21에 대해 특성화되었다. 이러한 데이터는 SCJ 투여를 통한 개별 안구 조직으로의 유전자 전달이 공식적인 가능성임을 입증했습니다.
이 백서에서는 마우스 모델에서 AAV 벡터를 전달하기 위한 SCJ 주입을 위한 간단하고 적응 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법의 재현성을 보장하기 위해 실체 현미경, 프로그래밍 가능한 주입/회수 주사기 펌프(일관되고 정확한 주입 속도 및 압력 허용) 및 미세 주입 바늘과 결합된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주입 시스템이 설명됩니다. 이 시스템은 작은 동물의 기질 내, 전방 내, 유리체 내 및 망막 하 주사와 같은 다른 안내 내 투여 경로에 적용 할 수 있습니다. 또한, 플루오레세인 염료는 종종 AAV 주사 부위의 시각화를 허용하기 위해 활용된다. 관리 경로의 주요 실제 단계, 주입 플랫폼 설정, 주입 준비 및 직접 경험의 팁에 대해 자세히 설명합니다. 마지막으로, 원하는 조직으로의 AAV 전달을 확인하기 위한 일반적인 검증 기술에 대해 간략하게 논의할 것이다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

안구 질환에는 여러 투여 경로를 통한 접근성이 상대적으로 쉽기 때문에 지역 약물 전달의 매력적인 표적이 되는 광범위한 유전 유전 및 후천성 장애가 포함됩니다. 결막하(SCJ) 주사는 간단하고 안전하며 일반적으로 외래 환자 환경에서 수행되기 때문에 다른 안내 투여 경로에 비해 이점을 제공합니다. 작은 동물에서 SCJ 주사는 일반적으로 눈의 크기 때문에 수술 현미경의 도움이 필요합니다. 이전 연구는 특정 아데노 관련 바이러스(AAV) 혈청형의 SCJ 주사가 안구 표면, 눈 근육, 각막 및 시신경의 표적 형질도입을 위한 유효한 유전자 전달 전략임을 입증하여 많은 안구 질환 치료를 위한 잠재적인 접근 방식을 제공합니다.
여기에서, 프로그램가능한 주입/회수 주사기 펌프(일관되고 정확한 주입 속도 및 압력을 허용함) 및 미세주입 바늘과 결합된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주입 시스템을 사용하는 마우스 모델에서 SCJ 주입에 대한 상세한 프로토콜이 제시된다. 주사 시스템은 또한 작은 동물에서 기질내, 전방내, 유리체내 및 망막하 주사와 같은 다른 안구내 투여 경로에 적응할 수 있습니다. 안구 유전자 요법 연구를 위한 아데노-관련 바이러스 벡터의 전달이 기재되어 있지만, 본원의 프로토콜은 또한 작은 동물 모델에서 다양한 안과용 용액에 대해 적응될 수 있다. 관리 경로의 주요 실제 단계, 주입 플랫폼 설정, 주입 준비 및 직접 경험의 팁에 대해 자세히 설명합니다. 또한, 원하는 조직으로의 AAV 전달 확인을 위한 일반적인 검증 기술도 간략하게 논의될 것이다.

결막 하 공간에 주입 된 용액은 주입 부피에 따라 bleb으로 나타납니다. 본 실험에서는 최종 농도 0.1%의 플루오레세인과 혼합된 AAV(7 × 109 바이러스 게놈(vg)/눈) 7μL를 실체현미경으로 36G 바늘로 주입하고, 프로그래밍 가능한 주사기 펌프를 사용하여 주입 속도/압력을 1μL/s로 일정하게 유지하였다. 주입시 블렙이 나타날 수 있습니다 (화살표). 뮤린 SCJ 구획에 투여된 AAV 벡터의...

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Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

이 원고에서 결막 하 주사는 주입 / 회수 주사기 펌프와 미세 주입 바늘과 결합 된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주사 시스템을 사용하여 마우스의 안구 조직에 대한 유효한 벡터 전달 방법으로 입증됩니다. 이 주사 시스템은 다른 안내 내 투여 경로에도 적용 가능합니다.

작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

이 프로토콜은 안전하고 쉽고 효과적인 방식으로 여러 안구 조직에 유전자 요법을 전달하는 방법을 제공합니다. 또한 작은 동물의 기질 내 및 망막 하 주사에도 적용 할 수 있습니다. 결막 하 주사 경로의 사용은 최소 침습적입니다.그것은 더 적은 위험을 제기하고 여러 안구 질환을 치료하기 위한 AV 전달에 대한 큰 약속을 가지고 있습니다. 전 세계적으로 10억 명이 넘는 사람들이 시각 장애로 고통받고 있는 상황에서 안전하고 쉬운 약물 전달 방법을 사용하면 다양한 실명 원인 치료에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 유전자 전달 방법은 잠재적 인 개입 전략을 개발하고 안과 의사를 개업하는 사람들에게 특히 관심이 있으며, 결국 이러한 약물을 환자에게 전달할 것입니다.이 프로토콜을 처음 수행하는 사람에게 가장 큰 도전은 개념 결막 공간에 바늘을 삽입하는 것입니다. 시작하려면 실체 현미경과 주사기 펌프를 생물 안전 캐비닛에 넣어 주입 시스템을 조립하십시오. 다음으로 폴리에틸렌 튜브를 약 50cm 길이로 자릅니다.36게이지 바늘의 끝을 튜브의 한쪽 끝에 삽입합니다. 그런 다음 일회용 3 밀리리터 주사기에 멸균 수를 채우고 바늘 반대쪽 튜브 측면에 삽입하십시오. 멸균수와 70% 알코올을 번갈아 가며 튜브를 세 번 세척하여 튜브를 소독하고 튜브 전체에 누출, 막힘 또는 손상이 없는지 확인합니다.일회용 3 밀리리터 주사기를 사용하여 튜브에 멸균 수를 채우고 튜브를 일회용 주사기에 부착 된 상태로 둡니다. 그런 다음 생물 안전 캐비닛 표면에 파라폼 조각을 놓고 멸균 수 풀을 추가하십시오. 바늘에 연결된 튜브 부분을 멸균 수 웅덩이에 담그십시오.그런 다음 주사기를 꺼낼 때 공기가 튜브 시스템으로 들어가는 것을 방지하기 위해 튜브 입구에서 일회용 주사기를 빼냅니다. 그런 다음 10 마이크로 리터 해밀턴 주사기에 멸균 수를 채 웁니다. 다음으로, 해밀턴 주사기의 바늘 끝을 파라 필름의 멸균수 풀에 담그어 해밀턴 주사기 바늘을 튜브의 열린 끝에 연결합니다.펌프 화면의 빠른 역방향 버튼을 길게 눌러 푸셔 블록을 주사기의 대략적인 길이로 이동합니다. 그런 다음 브래킷 클램핑 손잡이의 나사를 풀어 푸셔와 주사기 홀더 블록의 고정 브래킷을 풉니다. 그런 다음 Hamilton 주사기를 주사기 홀더 블록에 로드하고 제조업체의 지침에 따라 주사기를 고정합니다.펌프 설정 화면에서 매개변수를 조정하려면 힘" 버튼을 누르고 힘 수준을 30%그런 다음 변경 사항을 수락하여 설정 화면으로 돌아갑니다. 빠른 시작" 버튼을 누르고 방법을 선택한 다음 주입만" 옵션을 선택합니다. 주사기 옵션의 경우 Hamilton 1700을 선택한 다음 "유리"를 클릭하고 10 마이크로 리터를 선택하십시오.나중에 주입 속도와 주입량을 선택하십시오. Infuse" 버튼을 눌러 튜브와 주입 바늘에 물이 가득 찬 상태로 두고 Hamilton 주사기에서 물을 배출합니다. 다음으로, 주사 바늘을 바이러스 스톡의 분취량에 넣어 바이러스를 회수합니다.그런 다음 역방향 버튼을 눌러 해밀턴 주사기를 약간 뒤로 당겨 튜브에 작은 기포를 넣습니다. 동물을 마취 한 후 집게로 결막을 잡으십시오. 그런 다음 경사가 결막으로 완전히 덮일 때까지 바늘을 결막에 삽입하고 바늘을 지구본에 대십시오.동시에 풋 스위치를 사용하여 시작"버튼을 눌러 주입을 시작하십시오. AAV 벡터의 분포를 조사하기 위해, 안구 및 주변 조직을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 대표적인 시상 절편은 인도 잉크의 분산이 주로 안구 주위의 느슨한 결합 조직에서 공막의 외부 표면에있는 외안근에 인접하여 발생했음을 입증했다.주사 후 8주에 자가-보완 AAV 8의 형질도입을 확인하기 위해, 단면의 녹색 형광 단백질 풍부도를 면역형광 염색에 의해 조사하였다. 결과는 AAV 8 벡터가 눈과 각막 뒤쪽의 안구 주위 근육을 효율적으로 전달한다는 것을 밝혀냈다. 벡터 생체 분포를 분석하기 위해 간 및 심장을 포함한 다른 장기의 벡터 게놈 복제 수와 별개의 눈 구획을 전이 유전자에 특이적인 프라이머와 프로브를 사용하여 정량적 중합 효소 연쇄 반응으로 검사했습니다.전이유전자의 발현은 정량적 역전사 중합효소연쇄반응에 의해 확인되었으며, 이는 AAV 8의 결막하 주사가 눈꺼풀, 결막, 각막 및 시신경에서 전이유전자 발현을 초래함을 시사하였다. 기포는 튜브의 물과 치료 약물 사이의 장벽 역할을합니다. 이 기술을 통해 다른 연구자들은 여러 질병에 대한 안과 용액과 안구 유전자 요법 모두에 대한 결막 하 투여 경로의 사용을 탐색 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

재조합 Adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 벡터에 의해 간암 세포의 고효율 전달

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

연구

의학

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

마우스의 긴 기간 온 몸이 고열에 대한 프로토콜

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

큰 동물 모델에 대한 격리 된 작업 심장 시스템

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

마우스 경부 림프절의 고주파 초음파 이미징

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

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Vivo에서 골절 뼈 쥐 마우스 대 퇴 골에 대 한 MRI-호환 Osteosynthesis 장치를 사용 하 여 치료 기간 동안 굳은 살 개발의 평가

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

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Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

작은 동물 양전자 방출 단층 촬영 / 컴퓨터 단층 촬영에서 지속적인 혈액 샘플링은 동맥 입력 기능의 측정을 가능하게

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...