Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Forfatterne takker Vector Core ved University of North Carolina for å gi scAAV8-GFP-vektorene som ble brukt i denne studien, CGIBD Histology Core, og laboratoriet til Dr. Brian C. Gilger for deres hjelp med de kliniske vurderingsaspektene ved denne studien. Denne studien ble støttet av Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship og en karriereutviklingspris fra American Society of Gene & Cell Therapy og Cystic Fibrosis Foundation. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til American Society of Gene & Cell Therapy eller Cystic Fibrosis Foundation.

Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med forskriftene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved University of North Carolina på Chapel Hill. Bruken av AAV-vektorer er en biohazard risiko for biosikkerhet nivå 1. Bruk riktig personlig verneutstyr, inkludert laboratoriefrakk, hansker og vernebriller ved håndtering av AAV. For eksperimentet som er beskrevet her, ble en rekombinant AAV-vektor pakket med serotype 8-kapsiden og koding av en generisk allestedsnærværende cytomegalovirus (CMV) promotor som kon...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

AAV-mediert genterapi har et stort potensial for behandling av øyesykdommer. Nåværende okulær genterapi er avhengig av to store lokale administrasjonsveier, intravitreale og subretinale injeksjoner. Dessverre er begge rutene invasive og kan forårsake alvorlige komplikasjoner, inkludert retinal detachment, kataraktdannelse og endofthalmitis. Dermed er undersøkelsen av relativt mindre invasive ruter, som SCJ-injeksjon, av stor interesse.
Selv om denne teknikken er relativt enkel og betydel...

Okulære sykdommer omfatter et bredt spekter av både genetiske og ervervede lidelser. I 2015 var anslagsvis 36 millioner mennesker juridisk blinde over hele verden, og over 1 milliard mennesker lider av minst et visst nivå av synshemming, noe som understreker behovet for å oppskalere lindringsarbeidet på alle nivåer1. De viktigste metodene for å levere okulære medisiner inkluderer både lokal og lokal administrasjon, for eksempel øyedråper eller subkonjunktival (SCJ), intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner. Selv om ikke-invasiv topisk terapi er den vanligste leveringsmetoden for oftalmiske legemidler og er mye brukt for mange fremre segmentforstyrrelser, gir tilstedeværelsen av hornhindeanatomiske barrierer en utfordring for biotilgjengelighet, biodistribusjon og effekt av lokalt administrerte stoffer, noe som tyder på at det kanskje ikke er den beste kandidatbehandlingsruten for mange sykdommer i det indre øyet. Lokal injeksjon i det spesifikke okulære rommet som er berørt av sykdommen, vil sannsynligvis være en mer effektiv ogmålrettet tilnærming til legemiddellevering. Bivirkninger som følge av gjentatte injeksjoner kan imidlertid komplisere administrasjonsstrategier. Ideelt sett bør en behandling opprettholde langsiktig terapeutisk effekt etter en enkelt administrering. Dermed er genterapi et lovende alternativ for å minimere antall nødvendige injeksjoner og gi vedvarende transgenuttrykk for behandling av okulær sykdom 3,4.
Tallrike virale og ikke-virale vektorer er tilgjengelige for genterapi; AAV-vektorer er imidlertid av stor interesse på grunn av deres utmerkede sikkerhetsprofil. AAV er et lite, enkeltstrenget, ikke-innhyllet DNA-virus som opprinnelig ble oppdaget som en forurensning av et adenoviruspreparat i 1965 av Atchison et al.5,6 AAV ble senere konstruert som en effektiv virusvektor for genlevering på 1980-tallet og har blitt den foretrukne genterapivektoren for mange sykdommer, inkludert okulære lidelser, i løpet av de siste tiårene. Den mest bemerkelsesverdige av disse er det første kommersielt tilgjengelige genterapimedikamentet, voretigene neparvovec, som ble godkjent av USA Food and Drug Administration for å behandle Lebers medfødte amaurose, en sjelden bakre øyesykdom. Selv om voretigene neparvovec har lykkes med å overvinne barrierer for klinisk utvikling, gjenstår utfordringer for kommersialisering av ytterligere okulære genterapier. For eksempel administreres voretigene neparvovec til pasienter som beholder levedyktige retinale celler via subretinal injeksjon. Dermed er pasienter med mer avanserte former for sykdommen som mangler levedyktige retinale celler, ikke kvalifisert for behandling, da det ikke ville gi noen klinisk fordel. I tillegg ble det observert kjente komplikasjoner forbundet med subretinal injeksjonsprosedyre, inkludert øyebetennelse, grå stær, retinal tåre, makulopati og smerte 7,8. Andre bekymringer knyttet til denne prosedyren inkluderer muligheten for blødning, retinal detachment, endofthalmitis og tilbakekalling av okulær immun privilegert status gjennom øyevev ødeleggelse 9,10,11,12. Dermed har innsatsen for å utforske mindre invasive genleveringsruter som SCJ-injeksjon blitt stadig viktigere 13,14,15,16,17.
Konjunktivene er en tynn membran som inneholder 3-5 lag med celler og forbinder det fremre øyet med det indre øyelokket. SCJ-injeksjoner brukes klinisk for oftalmisk legemiddellevering til både fremre og / eller bakre segmenter av øyet for behandling av okulære sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon, glaukom, retinitt og bakre uveitt18,19. De er relativt enkle å utføre, brukes rutinemessig for oftalmisk legemiddellevering i en poliklinisk innstilling20, noe smertefri, kompromitterer ikke okulært immunprivilegium, og tillater administrerte legemidler å spre seg gjennom en stor periorbital region som omfatter optisk nerve. Derfor er SCJ-injeksjoner en attraktiv administrasjonsmåte for AAV-genterapiapplikasjoner. Naturlige AAV-serotyper administrert via SCJ-injeksjon hos mus har tidligere blitt karakterisert for sikkerhet, transduksjonseffektivitet, serumimmunogenisitet, biodistribusjon og vevsspesifisitet13,16,21. Disse dataene viste at genlevering til individuelle okulære vev via SCJ-administrasjon er en formell mulighet.
Denne rapporten beskriver en enkel og tilpasningsdyktig protokoll for SCJ-injeksjon for å levere AAV-vektorer i en musemodell. For å sikre reproduserbarheten av denne tilnærmingen beskrives et injeksjonssystem som består av et stereomikroskop, en programmerbar infusjons-/uttakssprøytepumpe (som muliggjør konsekvent og presis injeksjonshastighet og -trykk) og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Dette systemet er tilpasningsdyktig for andre intraokulære administrasjonsveier som intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner hos små dyr. I tillegg brukes ofte et fluoresceinfargestoff for å tillate visualisering av AAV-injeksjonsstedet. De viktigste praktiske trinnene i administrasjonsveien, oppsett for injeksjonsplattformen, tilberedning av injeksjonen og tips fra direkte erfaring vil bli diskutert i detalj. Til slutt vil vanlige valideringsteknikker for bekreftelse av AAV-levering til ønsket vev bli kort diskutert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Okulære sykdommer inkluderer et bredt spekter av arvelige genetiske og ervervede lidelser som er tiltalende mål for lokal legemiddellevering på grunn av deres relativt enkle tilgjengelighet via flere administrasjonsveier. Subkonjunktival (SCJ) injeksjoner gir fordeler i forhold til andre intraokulære administrasjonsveier, da de er enkle, trygge og vanligvis utføres i poliklinisk innstilling. SCJ-injeksjoner hos små dyr krever vanligvis hjelp fra et operasjonsmikroskop på grunn av øyets størrelse. Tidligere arbeid har vist at SCJ-injeksjon av spesifikke adeno-assosierte virus (AAV) serotyper er en gyldig genleveringsstrategi for målrettet transduksjon av okulær overflate, øyemuskel, hornhinnen og optisk nerve, noe som gir en potensiell tilnærming til behandling av mange okulære sykdommer.
Her presenteres en detaljert protokoll for SCJ-injeksjoner i en musemodell ved hjelp av et injeksjonssystem som består av en programmerbar infusjons-/uttakssprøytepumpe (som muliggjør konsekvent og presis injeksjonshastighet og -trykk) og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Injeksjonssystemet er også tilpasningsdyktig for andre intraokulære administrasjonsveier som intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner hos små dyr. Selv om levering av adenoassosierte virale vektorer for okulære genterapistudier er beskrevet, kan protokollen her også tilpasses for en rekke oftalmiske løsninger i små dyremodeller. De viktigste praktiske trinnene i administrasjonsveien, oppsett for injeksjonsplattformen, tilberedning av injeksjonen og tips fra direkte erfaring vil bli diskutert i detalj. I tillegg vil vanlige valideringsteknikker for AAV-leveringsbekreftelse til ønsket vev også bli kort diskutert.

Oppløsning injisert i subkonjunktivalrommet presenterer som en bleb avhengig av injeksjonsvolumet. I dette eksperimentet ble 7 μL AAV (7 × 109 virale genomer (vg) / øye) blandet med fluorescein ved en endelig konsentrasjon på 0,1% injisert med en 36 G nål under et stereomikroskop, og injeksjonshastigheten / trykket ble holdt konstant ved hjelp av en programmerbar sprøytepumpe ved 1 μL / s. En bleb kan vises ved injeksjon (pil). En mikroskopisk oversikt over administrering av AAV-vek...

Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

I dette manuskriptet er subkonjunktival injeksjon vist som en gyldig vektorleveringsmetode for okulært vev hos mus ved bruk av et injeksjonssystem bestående av en infusjons-/uttakssprøytepumpe og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Dette injeksjonssystemet kan også tilpasses andre intraokulære administrasjonsveier.

Subkonjunktiv administrering av adenoassosierte virusvektorer i små dyremodeller

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Denne protokollen tilbyr en metode for genterapilevering til flere okulære vev på en trygg, enkel og effektiv måte. Det er også tilpasningsdyktig for intrastromale og subretinale injeksjoner hos små dyr. Bruk av subkonjunktival injeksjonsrute er minimal invasiv.Det utgjør færre risikoer og har stort løfte om AV-levering for å behandle flere okulære sykdommer. Med over 1 milliard mennesker over hele verden som lider av synshemming, gir bruk av en trygg og enkel metode for legemiddellevering bred anvendelighet for behandling av mange forskjellige årsaker til blindhet. Genleveringsmetodene beskrevet i denne protokollen er av spesiell interesse for de som utvikler potensielle intervensjonsstrategier og praktiserer oftalmologer, som til slutt vil levere disse legemidlene til pasienter.Den største utfordringen for noen som utfører denne protokollen for første gang, er sannsynligvis innsetting av nålen i konseptet konjunktivrom. For å begynne, monter injeksjonssystemet ved å plassere et stereomikroskop og en sprøytepumpe i et biosikkerhetsskap. Kutt deretter polyetylenslangen til en lengde på omtrent 50 centimeter.Sett enden av en 36-gauge nål inn i den ene enden av slangen. Fyll deretter en engangs 3 milliliter sprøyte med sterilt vann og sett den inn i siden av røret motsatt nålen. Skyll slangen tre ganger, vekslende mellom sterilt vann og 70% alkohol for å desinfisere slangen og sikre at det ikke er lekkasjer, tresko eller skader i hele slangen.Bruk den engangs 3 milliliter sprøyten, fyll slangen med sterilt vann og la slangen være festet til engangssprøyten. Legg deretter et stykke parafoam på overflaten av bio-sikkerhetsskapet, og legg til et basseng med sterilt vann til det. Senk den delen av slangen som er koblet til nålen i bassenget med sterilt vann.Trekk deretter engangssprøyten ut fra røråpningen for å forhindre at luft kommer inn i slangesystemet når sprøyten fjernes. Fyll deretter en 10-mikroliters Hamilton-sprøyte med sterilt vann. Deretter kobler du Hamilton-sprøytenålen til den åpne enden av slangen ved å senke kanylespissen på Hamilton-sprøyten ned i bassenget med sterilt vann på parafilmen.Trykk og hold den raske reversknappen på pumpeskjermen for å flytte skyveblokkene til sprøytens omtrentlige lengde. Skru deretter av klemmeknappene for braketten for å løsne festebrakettene på skyveren og sprøyteholderblokkene. Deretter legger du Hamilton-sprøyten på sprøyteholderblokken og fester sprøyten i henhold til produsentens instruksjoner.For å justere parametrene i pumpeinnstillingsskjermen, trykk på Force"-knappen og sett kraftnivået til 30% Godta deretter endringene for å gå tilbake til innstillingsskjermen. Trykk på Hurtigstart"-knappen, velg Metode, og velg deretter alternativet Infuse Only". For sprøytealternativet, velg Hamilton 1700, klikk deretter på Glass"og velg 10 mikroliter.Senere velger du infusjonshastigheten og injeksjonsvolumet. Løs ut vannet fra Hamilton-sprøyten mens slangen og injeksjonsnålen er full av vann ved å trykke på Infuse-knappen. Deretter trekker du ut viruset ved å plassere injeksjonsnålen i en aliquot av virusstammen.Trekk deretter litt tilbake på Hamilton-sprøyten ved å trykke på reversknappen for å introdusere en liten luftboble i slangen. Etter å ha bedøvet dyret, ta tak i bindehinden med tang. Sett deretter nålen inn i bindehinden til skråkanten er helt dekket av konjunktivmembranen, og legg nålen mot kloden.Start injeksjonen samtidig ved å trykke på Start-knappen ved hjelp av fotbryteren. For å undersøke fordelingen av AAV-vektoren ble okulært og omkringliggende vev farget med hematoksylin og eosin. De representative sagittalseksjonene viste at spredningen av India-blekk hovedsakelig skjedde ved siden av de ekstraokulære musklene i den ytre overflaten av sclera i det periokulære løse bindevevet.For å bekrefte transduksjon av selvkomplementær AAV 8 åtte uker etter injeksjon, ble grønn fluorescensproteinoverflod i tverrsnittene undersøkt ved immunfluorescensfarging. Resultatene viste at AAV 8-vektorer effektivt transduserte de periokulære musklene bakre til øyet og hornhinnen. For å analysere vektorbiofordelingen ble vektorgenomkopieringsnumre og distinkte øyerom i andre organer, inkludert lever og hjerte, undersøkt ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon ved bruk av primere og prober som er spesifikke for transgenet.Ekspresjon av transgenet ble bekreftet ved kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon, noe som antydet at subkonjunktival injeksjon av AAV 8 resulterer i transgenuttrykk i øyelokk, konjunktiv, hornhinne og optisk nerve. Luftboblen vil tjene som en barriere mellom vannet i røret og det terapeutiske legemidlet. Denne teknikken gjør det mulig for andre forskere å utforske bruken av den subkonjunktivale administrasjonsveien for både oftalmiske løsninger og okulære genterapier for flere sykdommer.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protokoll for lang varighet Whole Body Hypertermi i Mus

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Et isolert Working Hjerte System for stort dyr modeller

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Ved hjelp adenoassosiert virus som et verktøy for å studere Retinal Barrierer i Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Høyfrekvente ultralydavbildning av Muse Cervical lymfeknuter

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

I Vivo Evaluering av brudd Callus utvikling i bein Healing i mus bruker en MRI-kompatibel Osteosynthesis enhet for musen Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten dyr modell av Ex Vivo Normothermic lever perfusjon

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Adeno-assosiert Virus-mediert levering av CRISPR for Cardiac genet redigering i mus

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

Kontinuerlig blodprøve i små dyr positron utslipp tomografi/beregnet tomografi muliggjør måling av arteriell input-funksjonen

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...