Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
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Os autores agradecem ao Vector Core da Universidade da Carolina do Norte por fornecer os vetores scAAV8-GFP usados neste estudo, o CGIBD Histology Core e o laboratório do Dr. Brian C. Gilger por sua assistência com os aspectos de avaliação clínica deste estudo. Este estudo foi apoiado pela Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship e um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Sociedade Americana de Terapia Genética e Celular e da Cystic Fibrosis Foundation. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais da Sociedade Americana de Terapia Genética e Celular ou da Fundação de Fibrose Cística.

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. O uso de vetores AAV é um risco de biossegurança Nível 1. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo um jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear o AAV. Para o experimento aqui descrito, foi utilizado um vetor AAV recombinante embalado com o capsídeo do sorotipo 8 e codificando um promotor genérico de cit...

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	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

A terapia genética mediada por AAV tem um grande potencial para o tratamento de doenças oculares. A terapia genética ocular atual depende de duas vias principais de administração local, injeções intravítreas e sub-retinianas. Infelizmente, ambas as vias são invasivas e podem causar sérias complicações, incluindo descolamento de retina, formação de catarata e endoftalmite. Assim, a investigação de vias relativamente menos invasivas, como a injeção de SCJ, é de grande interesse.
<p class="jove_conten...

As doenças oculares abrangem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos. Em 2015, estima-se que 36 milhões de pessoas eram legalmente cegas em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas sofrem de pelo menos algum nível de deficiência visual, destacando a necessidade de ampliar os esforços de alívio em todos os níveis1. Os principais métodos para a administração de medicamentos oculares incluem administração tópica e local, como colírios ou injeções subconjuntivais (SCJ), intracamerais, intravítreas e sub-retinianas. Embora a terapia tópica não invasiva seja o método de administração mais comum para drogas oftálmicas e seja amplamente utilizada para muitos distúrbios do segmento anterior, a presença de barreiras anatômicas da córnea apresenta um desafio para a biodisponibilidade, biodistribuição e eficácia de substâncias administradas topicamente, sugerindo que pode não ser a melhor via de tratamento candidata para muitas doenças do olho interno. A injeção local no compartimento ocular específico afetado pela doença provavelmente será uma abordagem de liberação de medicamentos mais eficaz e direcionada2. No entanto, os efeitos adversos resultantes de injeções repetidas podem complicar as estratégias de administração. Idealmente, uma terapia deve manter a eficácia terapêutica a longo prazo após uma única administração. Assim, a terapia gênica é uma opção promissora para minimizar o número de injeções necessárias e proporcionar expressão transgênica sustentada para o tratamento da doença ocular 3,4.
Numerosos vetores virais e não virais estão disponíveis para terapia gênica; no entanto, os vetores AAV são de alto interesse devido ao seu excelente perfil de segurança. O AAV é um vírus de DNA pequeno, de fita simples e não envelopado, que foi inicialmente descoberto como contaminante de uma preparação de adenovírus em 1965 por Atchison et al.5,6 O AAV foi posteriormente modificado como um vetor viral eficiente para a entrega de genes na década de 1980 e tornou-se o vetor de terapia gênica de escolha para muitas doenças, incluindo distúrbios oculares, ao longo das últimas décadas. O mais notável deles é o primeiro medicamento de terapia genética comercialmente disponível, o voretigene neparvovec, que foi aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para tratar a Amaurose Congênita de Leber, uma doença ocular posterior rara. Embora o voretigene neparvovec tenha superado com sucesso as barreiras ao desenvolvimento clínico, ainda existem desafios para a comercialização de terapias genéticas oculares adicionais. Por exemplo, o voretigene neparvovec é administrado a doentes que retêm células viáveis da retina através de injeção sub-retiniana. Assim, pacientes com formas mais avançadas da doença que não possuem células retinianas viáveis não são elegíveis para o tratamento, pois não proporcionaria nenhum benefício clínico. Além disso, complicações conhecidas associadas ao procedimento de injeção sub-retiniana foram observadas, incluindo inflamação ocular, catarata, lacrimejamento da retina, maculopatia e dor 7,8. Outras preocupações relacionadas a esse procedimento incluem a possibilidade de hemorragia, descolamento de retina, endoftalmite e revogação do estado imune privilegiado ocular por meio da destruição do tecido ocular 9,10,11,12. Assim, os esforços para explorar rotas de entrega de genes menos invasivas, como a injeção de SCJ, têm se tornado cada vez mais importantes 13,14,15,16,17.
A conjuntiva é uma membrana fina contendo 3-5 camadas de células e conectando o olho anterior à pálpebra interior. As injeções de SCJ são usadas clinicamente para a administração oftálmica de drogas nos segmentos anterior e/ou posterior do olho para o tratamento de doenças oculares, como degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinite e uveíte posterior18,19. Eles são relativamente simples de serem realizados, empregados rotineiramente para a administração de medicamentos oftálmicos em ambiente ambulatorial20, um pouco indolores, não comprometem o privilégio imunológico ocular e permitem que os medicamentos administrados se espalhem por uma grande região periorbital que engloba o nervo óptico. Assim, as injeções de SCJ são uma via atraente de administração para aplicações de terapia gênica AAV. Os sorotipos naturais de AAV administrados por injeção de SCJ em camundongos foram previamente caracterizados quanto à segurança, eficiência de transdução, imunogenicidade sérica, biodistribuição e especificidade tecidual13,16,21. Estes dados demonstraram que a entrega de genes a tecidos oculares individuais através da administração de SCJ é uma possibilidade formal.
Este artigo descreve um protocolo simples e adaptável para injeção de SCJ para fornecer vetores AAV em um modelo de camundongo. Para garantir a reprodutibilidade desta abordagem, é descrito um sistema de injeção constituído por um estereomicroscópio, uma bomba de seringa de infusão/retirada programável (que permite uma velocidade e pressão de injeção consistentes e precisas) e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema é adaptável para outras vias de administração intraocular, como injeções intraestromais, intracamerais, intravítreas e sub-retinianas em pequenos animais. Além disso, um corante fluoresceína é frequentemente utilizado para permitir a visualização do local de injeção de AAV. As principais etapas práticas na via de administração, configuração para a plataforma de injeção, preparação da injeção e dicas da experiência direta serão discutidas em detalhes. Finalmente, técnicas comuns de validação para confirmação da entrega de AAV aos tecidos desejados serão brevemente discutidas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

As doenças oculares incluem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos hereditários que são alvos atraentes para a administração local de medicamentos devido à sua relativa facilidade de acessibilidade através de várias vias de administração. As injeções subconjuntivais (SCJ) oferecem vantagens em relação a outras vias de administração intraocular, pois são simples, seguras e geralmente realizadas em ambiente ambulatorial. As injeções de SCJ em pequenos animais geralmente requerem a assistência de um microscópio cirúrgico devido ao tamanho do olho. Trabalhos anteriores demonstraram que a injeção de SCJ de sorotipos específicos de vírus adenoassociados (AAV) é uma estratégia válida de entrega de genes para transdução direcionada da superfície ocular, músculo ocular, córnea e nervo óptico, fornecendo uma abordagem potencial para o tratamento de muitas doenças oculares.
Neste documento, um protocolo detalhado é apresentado para injeções SCJ em um modelo de camundongo usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada programável (que permite velocidade e pressão de injeção consistentes e precisas) e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. O sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular, como injeções intraestromais, intracamerais, intravítreas e sub-retinianas em pequenos animais. Embora a entrega de vetores virais adenoassociados para estudos de terapia gênica ocular seja descrita, o protocolo aqui também pode ser adaptado para uma variedade de soluções oftálmicas em pequenos modelos animais. As principais etapas práticas na via de administração, configuração para a plataforma de injeção, preparação da injeção e dicas da experiência direta serão discutidas em detalhes. Além disso, técnicas comuns de validação para a confirmação da entrega de AAV aos tecidos desejados também serão brevemente discutidas.

A solução injetada no espaço subconjuntival apresenta-se como uma bolha dependendo do volume de injeção. Neste experimento, 7 μL de AAV (7 × 109 genomas virais (vg)/olho) misturados com fluoresceína na concentração final de 0,1% foram injetados com uma agulha de 36 G sob estereomicroscópio, e a velocidade/pressão de injeção foi mantida constante usando uma bomba de seringa programável a 1 μL/s. Uma bolha pode aparecer após a injeção (seta). Uma visão microscópica da adm...

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Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.

Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Este protocolo oferece um método de entrega de terapia genética a múltiplos tecidos oculares de forma segura, fácil e eficaz. Também é adaptável para injeções intraestromais e sub-retinianas em pequenos animais. A utilização da via de injeção subconjuntival é minimamente invasiva.Representa menos riscos e é uma grande promessa para a entrega de AV para tratar múltiplas doenças oculares. Com mais de 1 bilhão de pessoas em todo o mundo sofrendo de deficiência visual, o uso de um método seguro e fácil para a administração de medicamentos oferece ampla aplicabilidade para o tratamento de muitas causas diferentes de cegueira. Os métodos de entrega de genes descritos neste protocolo são de particular interesse para aqueles que estão desenvolvendo potenciais estratégias de intervenção e praticando oftalmologistas, que eventualmente entregarão esses medicamentos aos pacientes.O maior desafio para alguém que está realizando este protocolo pela primeira vez é provavelmente a inserção da agulha no conceito de espaço conjuntival. Para começar, monte o sistema de injeção colocando um microscópio estéreo e uma bomba de seringa em um gabinete de biossegurança. Em seguida, corte a tubulação de polietileno em um comprimento de aproximadamente 50 centímetros.Insira a extremidade de uma agulha de calibre 36 em uma extremidade da tubulação. Em seguida, encha uma seringa descartável de 3 mililitros com água estéril e insira-a no lado do tubo oposto à agulha. Lave a tubulação três vezes, alternando entre água estéril e álcool a 70% para desinfetar a tubulação e garantir que não haja vazamentos, entupimentos ou danos em toda a tubulação.Usando a seringa descartável de 3 mililitros, encha a tubulação com água estéril e deixe a tubulação presa à seringa descartável. Em seguida, coloque um pedaço de paraespuma na superfície do gabinete de biossegurança e adicione uma piscina de água estéril a ele. Submerja a parte da tubulação conectada à agulha na piscina de água estéril.Em seguida, puxe a seringa descartável para fora da abertura do tubo para evitar que qualquer ar entre no sistema de tubos após a remoção da seringa. Em seguida, encha uma seringa Hamilton de 10 microlitros com água estéril. Em seguida, conecte a agulha da seringa Hamilton à extremidade aberta da tubulação submergindo a ponta da agulha da seringa Hamilton na piscina de água estéril no filme para.Mantenha pressionado o botão de marcha à ré rápida na tela da bomba para mover os blocos de pressão para o comprimento aproximado da seringa. Em seguida, desenrosque os botões de fixação do suporte para soltar os suportes de retenção no empurrador e os blocos do suporte da seringa. Subsequentemente, carregue a seringa Hamilton no bloco do suporte da seringa e prenda a seringa de acordo com as instruções do fabricante.Para ajustar os parâmetros na tela de configuração da bomba, pressione o botão Force"e defina o nível de força em 30% Em seguida, aceite as alterações para voltar à tela de configuração. Pressione o botão Início Rápido", selecione Método e, em seguida, selecione a opção "Injetar somente". Para a opção de seringa, selecione Hamilton 1700, clique em "Vidro" e selecione 10 microlitros.Mais tarde, selecione a velocidade de perfusão e o volume de injeção. Ejete a água da seringa Hamilton enquanto deixa a tubulação e a agulha de injeção cheias de água pressionando o botão "Infuse". Em seguida, retire o vírus colocando a agulha de injeção em uma alíquota do estoque de vírus.Em seguida, puxe ligeiramente para trás a seringa Hamilton pressionando o botão reverso para introduzir uma pequena bolha de ar na tubulação. Depois de anestesiar o animal, pegue a conjuntiva com fórceps. Em seguida, insira a agulha na conjuntiva até que o bisel esteja totalmente coberto pela membrana conjuntival e coloque a agulha contra o globo.Simultaneamente, inicie a injeção pressionando o botão Start"" usando o interruptor de pé. Para examinar a distribuição do vetor AAV, os tecidos oculares e circundantes foram corados com hematoxilina e eosina. Os cortes sagitais representativos demonstraram que a dispersão da tinta da Índia ocorreu principalmente adjacente aos músculos extraoculares na superfície externa da esclera nos tecidos conjuntivos peroculares soltos.Para confirmar a transdução do AAV 8 auto-complementar às oito semanas após a injeção, a abundância de proteína de fluorescência verde nos cortes transversais foi examinada por coloração por imunofluorescência. Os resultados revelaram que os vetores AAV 8 transduziram eficientemente os músculos perioculares posteriores ao olho e à córnea. Para analisar a biodistribuição vetorial, os números de cópias do genoma vetorial e compartimentos oculares distintos em outros órgãos, incluindo fígado e coração, foram examinados por reação quantitativa em cadeia da polimerase usando primers e sondas específicas para o transgene.A expressão do transgene foi confirmada pela reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa, que sugeriu que a injeção subconjuntival de AAV 8 resulta em expressão transgênica na pálpebra, conjuntiva, córnea e nervo óptico. A bolha de ar servirá como uma barreira entre a água no tubo e a droga terapêutica. Esta técnica permite que outros pesquisadores explorem o uso da via subconjuntival de administração para soluções oftálmicas e terapias genéticas oculares para múltiplas doenças.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

De Alta Eficiência Transdução de células de câncer de fígado por recombinante sorotipo de vírus adeno-associado 3 Vetores

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Medicina

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protocolo para Longa Duração Hipertermia corpo inteiro em Ratos

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Um Sistema de coração isolado para Grandes Modelos Animais

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

De alta frequência Ecografia de mouse linfonodos cervicais

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Na Vivo Avaliação do desenvolvimento de calo de fratura durante a consolidação óssea em ratos usando um dispositivo de osteossíntese compatível com MRI para o fêmur de Mouse

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

A amostragem contínua do sangue no tomography de emissão de Positron animal pequeno/tomography computado permite a medida da função de entrada arterial

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...