Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Авторы благодарят Vector Core в Университете Северной Каролины за предоставление векторов scAAV8-GFP, используемых в этом исследовании, CGIBD Histology Core и лаборатории доктора Брайана С. Гилгера за их помощь в аспектах клинической оценки этого исследования. Это исследование было поддержано Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship и премией за развитие карьеры от Американского общества генной и клеточной терапии и Фонда муковисцидоза. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Американского общества генной и клеточной терапии или Фонда муковисцидоза.

Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с правилами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл. Использование переносчиков AAV представляет собой риск биологической опасности уровня биобезопасн?...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

AAV-опосредованная генная терапия обладает большим потенциалом для лечения глазных заболеваний. Современная глазная генная терапия опирается на два основных пути местного введения: интравитреальные и субретинальные инъекции. К сожалению, оба пути являются инвазивными и могут вызвать ...

Глазные заболевания охватывают широкий спектр как генетических, так и приобретенных расстройств. По оценкам, в 2015 году 36 миллионов человек во всем мире были юридически слепыми, и более 1 миллиарда человек страдают, по крайней мере, от некоторого уровня нарушений зрения, что подчеркивает необходимость наращивания усилий по смягчению последствий на всех уровнях1. Основные методы доставки глазных препаратов включают как местное, так и местное введение, такое как глазные капли или субконъюнктивальные (SCJ), внутрикамерные, интравитреальные и субретинальные инъекции. Хотя неинвазивная местная терапия является наиболее распространенным методом доставки офтальмологических препаратов и широко используется для многих заболеваний переднего сегмента, наличие анатомических барьеров роговицы представляет собой проблему для биодоступности, биораспределения и эффективности местно вводимых веществ, предполагая, что это может быть не лучшим кандидатом на лечение многих заболеваний внутреннего глаза. Местная инъекция в специфический глазной компартмент, пораженный заболеванием, вероятно, будет более эффективным и целенаправленным подходом к доставке лекарств2. Однако побочные эффекты, возникающие в результате повторных инъекций, могут усложнить стратегии введения. В идеале терапия должна поддерживать долгосрочную терапевтическую эффективность после однократного введения. Таким образом, генная терапия является перспективным вариантом минимизации количества необходимых инъекций и обеспечения устойчивой трансгенной экспрессии для лечения глазного заболевания 3,4.
Многочисленные вирусные и невирусные векторы доступны для генной терапии; однако векторы AAV представляют большой интерес из-за их превосходного профиля безопасности. AAV представляет собой небольшой, одноцепочечный, необолоченный ДНК-вирус, который был первоначально обнаружен как загрязнитель аденовирусного препарата в 1965 году Атчисоном и др.5,6 AAV был впоследствии спроектирован как эффективный вирусный вектор для доставки генов в 1980-х годах и стал вектором генной терапии выбора для многих заболеваний, включая глазные расстройства, за последние несколько десятилетий. Наиболее заметным из них является первый коммерчески доступный препарат генной терапии, voretigene neparvovec, который был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения врожденного амавроза Лебера, редкого заболевания заднего глаза. Хотя voretigene neparvovec успешно преодолел барьеры на пути клинической разработки, остаются проблемы для коммерциализации дополнительной глазной генной терапии. Например, воретиген непарвовец вводят пациентам, которые сохраняют жизнеспособные клетки сетчатки с помощью субретинальной инъекции. Таким образом, пациенты с более продвинутыми формами заболевания, у которых отсутствуют жизнеспособные клетки сетчатки, не имеют права на лечение, поскольку оно не принесет никакой клинической пользы. Кроме того, наблюдались известные осложнения, связанные с процедурой субретинальной инъекции, включая воспаление глаз, катаракту, слезотечение сетчатки, макулопатию и боль 7,8. Другие проблемы, связанные с этой процедурой, включают возможность кровоизлияния, отслоения сетчатки, эндофтальмита и отзыва иммунного привилегированного статуса глаза через разрушение тканей глаза 9,10,11,12. Таким образом, усилия по изучению менее инвазивных путей доставки генов, таких как инъекция SCJ, становятся все болееважными 13,14,15,16,17.
Конъюнктива представляет собой тонкую мембрану, содержащую 3-5 слоев клеток и соединяющую передний глаз с внутренним веком. Инъекции SCJ клинически используются для доставки офтальмологических препаратов как в передний, так и/или задний сегменты глаза для лечения глазных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация, глаукома, ретинит и задний увеит 18,19. Они относительно просты в выполнении, регулярно используются для доставки офтальмологических препаратов в амбулаторных условиях20, несколько безболезненны, не ставят под угрозу иммунную привилегию глаза и позволяют вводимым препаратам распространяться через большую периорбитальную область, которая охватывает зрительный нерв. Следовательно, инъекции SCJ являются привлекательным способом введения для применения генной терапии AAV. Естественные серотипы AAV, вводимые с помощью инъекций SCJ у мышей, ранее были охарактеризованы по безопасности, эффективности трансдукции, иммуногенности сыворотки, биораспределению и специфичности тканей 13,16,21. Эти данные показали, что доставка генов в отдельные глазные ткани через введение SCJ является формальной возможностью.
В этом документе описывается простой и адаптируемый протокол для внедрения SCJ для доставки векторов AAV в модель мыши. Для обеспечения воспроизводимости этого подхода описана система впрыска, состоящая из стереомикроскопа, программируемого инфузионно-выводного шприцевого насоса (который обеспечивает постоянную и точную скорость и давление впрыска) и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Эта система адаптируется для других внутриглазных путей введения, таких как интрастромальные, интракамерные, интравитреальные и субретинальные инъекции у мелких животных. Кроме того, для визуализации места инъекции AAV часто используется флуоресцеиновый краситель. Будут подробно рассмотрены ключевые практические шаги в пути введения, настройка для инъекционной платформы, подготовка инъекции и советы из непосредственного опыта. Наконец, будут кратко рассмотрены общие методы валидации для подтверждения доставки AAV в желаемые ткани.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Глазные заболевания включают в себя широкий спектр наследственных генетических и приобретенных расстройств, которые являются привлекательными целями для местной доставки лекарств из-за их относительной легкости доступа через несколько способов введения. Субконъюнктивальные (SCJ) инъекции предлагают преимущества по сравнению с другими путями внутриглазного введения, поскольку они просты, безопасны и обычно выполняются в амбулаторных условиях. Инъекции SCJ мелким животным обычно требуют помощи операционного микроскопа из-за размера глаза. Предыдущая работа показала, что инъекция SCJ специфических серотипов аденоассоциированного вируса (AAV) является действительной стратегией доставки генов для целенаправленной трансдукции глазной поверхности, глазной мышцы, роговицы и зрительного нерва, обеспечивая потенциальный подход к лечению многих глазных заболеваний.
В настоящем документе представлен подробный протокол для инъекций SCJ в мышиной модели с использованием системы впрыска, состоящей из программируемого инфузионно-выводного шприцевого насоса (который обеспечивает постоянную и точную скорость и давление впрыска) и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Система инъекций также адаптируется для других внутриглазных путей введения, таких как интрастромальные, внутрикамерные, интравитреальные и субретинальные инъекции у мелких животных. Хотя описана доставка аденоассоциированных вирусных векторов для исследований глазной генной терапии, протокол в настоящем описании также может быть адаптирован для различных офтальмологических растворов на моделях мелких животных. Будут подробно рассмотрены ключевые практические шаги в пути введения, настройка для инъекционной платформы, подготовка инъекции и советы из непосредственного опыта. Кроме того, будут кратко обсуждены общие методы валидации для подтверждения доставки AAV в желаемые ткани.

Раствор, вводимый в субконъюнктивальное пространство, представляет собой блеб в зависимости от объема инъекции. В этом эксперименте 7 мкл AAV (7 × 109 вирусных геномов (vg)/глаз), смешанных с флуоресцеином в конечной концентрации 0,1%, вводили иглой 36 G под стереомикроскопом, а с...

Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

В этой рукописи субконъюнктивальная инъекция демонстрируется как действительный векторный метод доставки для глазных тканей у мышей с использованием системы инъекций, состоящей из инфузионно-выводного шприцевого насоса и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Эта система инъекций также адаптируется для других внутриглазных путей введения.

Субконъюнктивальное введение аденоассоциированных вирусных векторов в моделях мелких животных

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Этот протокол предлагает метод доставки генной терапии к нескольким глазным тканям безопасным, простым и эффективным способом. Он также адаптируется для интрастромальных и субретинальных инъекций у мелких животных. Использование субконъюнктивального пути инъекции является минимально инвазивным.Это создает меньше рисков и имеет большие перспективы для доставки AV для лечения нескольких глазных заболеваний. Поскольку более 1 миллиарда человек во всем мире страдают от нарушений зрения, использование безопасного и простого метода доставки лекарств обеспечивает широкое применение для лечения многих различных причин слепоты. Методы доставки генов, описанные в этом протоколе, представляют особый интерес для тех, кто разрабатывает потенциальные стратегии вмешательства и практикующих офтальмологов, которые в конечном итоге доставят эти препараты пациентам.Самой большой проблемой для тех, кто выполняет этот протокол впервые, вероятно, является введение иглы в понятие конъюнктивального пространства. Для начала соберите систему впрыска, поместив стереомикроскоп и шприцевой насос в шкаф биобезопасности. Далее разрезаем полиэтиленовую трубку на длину примерно 50 сантиметров.Вставьте конец иглы 36-го калибра в один конец трубки. Затем наполните одноразовый 3-миллилитровый шприц стерильной водой и вставьте его в сторону трубки напротив иглы. Промывайте трубку три раза, чередуя стерильную воду и 70% спирт, чтобы дезинфицировать трубку и убедиться, что нет утечек, засоров или повреждений по всей трубке.Используя одноразовый 3-миллилитровый шприц, наполните трубку стерильной водой и оставьте трубку прикрепленной к одноразовому шприцу. Затем поместите кусок пенопласта на поверхность шкафа биобезопасности и добавьте в него бассейн со стерильной водой. Погрузите часть трубки, подключенную к игле, в бассейн со стерильной водой.Затем вытащите одноразовый шприц из отверстия трубки, чтобы предотвратить попадание воздуха в систему трубок после извлечения шприца. Затем наполните 10-микролитровый шприц Гамильтона стерильной водой. Затем подключите иглу шприца Гамильтона к открытому концу трубки, погружая кончик иглы шприца Гамильтона в бассейн со стерильной водой на парапленке.Нажмите и удерживайте быструю кнопку заднего хода на экране насоса, чтобы переместить толкающие блоки на приблизительную длину шприца. Затем открутите зажимные ручки кронштейна, чтобы ослабить стопорные кронштейны на толкателе и блоках держателя шприца. Затем загрузите шприц Hamilton на блок держателя шприца и закрепите шприц в соответствии с инструкциями производителя.Чтобы настроить параметры на экране настроек насоса, нажмите кнопку «Усилие» и установите уровень силы на уровне 30%Затем примите изменения, чтобы вернуться на экран настроек. Нажмите кнопку «Быстрый запуск», выберите «Метод», а затем выберите параметр «Только вливать». Для варианта шприца выберите Hamilton 1700, затем нажмите «Стекло» и выберите 10 микролитров.Затем выберите скорость инфузии и объем инъекции. Извлеките воду из шприца Гамильтона, оставив трубку и инъекционную иглу, наполненную водой, нажав кнопку Infuse". Затем выведите вирус, поместив инъекционную иглу в аликвоту запаса вируса.Затем слегка потяните назад шприц Гамильтона, нажав кнопку обратного хода, чтобы ввести небольшой пузырь воздуха в трубку. После обезболивания животного захватите конъюнктиву щипцами. Затем вставьте иглу в конъюнктиву до тех пор, пока скос не будет полностью покрыт мембраной конъюнктивы, и положите иглу на глобус.Одновременно запустите инъекцию, нажав кнопку Пуск с помощью ножного переключателя. Для изучения распределения вектора AAV глазные и окружающие ткани окрашивали гематоксилином и эозином. Репрезентативные сагиттальные срезы показали, что рассеивание индийских чернил происходило в основном рядом с экстраокулярными мышцами на внешней поверхности склеры в периокулярных рыхлых соединительных тканях.Чтобы подтвердить трансдукцию самокомплектного AAV 8 через восемь недель после инъекции, обилие белка зеленой флуоресценции в поперечных сечениях исследовали иммунофлуоресцентным окрашиванием. Результаты показали, что векторы AAV 8 эффективно трансдуцировали периокулярные мышцы сзади от глаза и роговицы. Чтобы проанализировать векторное биораспределение, номера копий векторного генома и отдельные глазные компартменты в других органах, включая печень и сердце, были исследованы количественной полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров и зондов, специфичных для трансгена.Экспрессия трансгена была подтверждена количественной полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией, которая предполагала, что субконъюнктивальная инъекция AAV 8 приводит к экспрессии трансгена в веке, конъюнктиве, роговице и зрительном нерве. Воздушный пузырь будет служить барьером между водой в трубке и лечебным препаратом. Этот метод позволяет другим исследователям исследовать использование субконъюнктивального пути введения как для офтальмологических растворов, так и для глазной генной терапии для множественных заболеваний.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Высокоэффективные трансдукция клеток рака печени с помощью рекомбинантной адено-ассоциированные вирус серотипа 3 Вектора

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Протокол в течение длительного периода общей управляемой гипертермии у мышей

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Изолированная система работы сердца для крупных животных моделях

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Использование аденоассоциированные Касперского как инструмент для изучения сетчатки барьеров при болезни

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Высокочастотный ультразвуковой визуализации мыши шейных лимфатических узлов

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

В естественных условиях Оценка развития каллуса перелом кости Исцеление у мышей с использованием МРТ совместимое устройство остеосинтеза для мыши бедренной

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Мелких животных модель Ex Vivo нормотермических печени перфузии

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Аденоассоциированный вирус опосредованной доставку ТРИФОСФАТЫ сердечной гена, редактирования в мышей

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

Непрерывная выборка крови в малой животной позитронно-эмиссионной томографии / компьютерная томография позволяет измерения артериальной функции ввода

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...