Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
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Los autores agradecen al Vector Core de la Universidad de Carolina del Norte por proporcionar los vectores scAAV8-GFP utilizados en este estudio, el CGIBD Histology Core y el laboratorio del Dr. Brian C. Gilger por su ayuda con los aspectos de evaluación clínica de este estudio. Este estudio fue apoyado por la Beca Postdoctoral Distinguida de Pfizer-NC Biotech y un Premio de Desarrollo Profesional de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular y la Fundación de Fibrosis Quística. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular o la Fundación de Fibrosis Quística.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. El uso de vectores AAV es un riesgo de riesgo biológico de nivel 1 de bioseguridad. Use el equipo de protección personal adecuado, incluida una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras cuando manipule AAV. Para el experimento descrito en la presente invención, se utilizó un vector AAV recombinante empaquetado con la c...

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	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. 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W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

La terapia génica mediada por AAV tiene un gran potencial para el tratamiento de enfermedades oculares. La terapia génica ocular actual se basa en dos vías principales de administración local, inyecciones intravítreas y subretinianas. Desafortunadamente, ambas rutas son invasivas y pueden causar complicaciones graves, como desprendimiento de retina, formación de cataratas y endoftalmitis. Por lo tanto, la investigación de rutas relativamente menos invasivas, como la inyección de SCJ, es de gran interés.
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Las enfermedades oculares abarcan una amplia gama de trastornos genéticos y adquiridos. En 2015, se estima que 36 millones de personas eran legalmente ciegas en todo el mundo, y más de 1.000 millones de personas sufren de al menos algún nivel de discapacidad visual, lo que destaca la necesidad de ampliar los esfuerzos de alivio en todos los niveles1. Los principales métodos para administrar medicamentos oculares incluyen la administración tópica y local, como gotas para los ojos o inyecciones subconjuntivales (SCJ), intracamerales, intravítreas y subretinianas. Aunque la terapia tópica no invasiva es el método de administración más común para los fármacos oftálmicos y se usa ampliamente para muchos trastornos del segmento anterior, la presencia de barreras anatómicas corneales presenta un desafío para la biodisponibilidad, biodistribución y eficacia de las sustancias administradas tópicamente, lo que sugiere que puede no ser la mejor ruta de tratamiento candidata para muchas enfermedades del ojo interno. Es probable que la inyección local en el compartimiento ocular específico afectado por la enfermedad sea un enfoque de administración de fármacos más eficaz y dirigido2. Sin embargo, los efectos adversos resultantes de las inyecciones repetidas pueden complicar las estrategias de administración. Idealmente, una terapia debe mantener la eficacia terapéutica a largo plazo después de una sola administración. Por lo tanto, la terapia génica es una opción prometedora para minimizar el número de inyecciones requeridas y proporcionar una expresión transgénica sostenida para el tratamiento de la enfermedad ocular 3,4.
Numerosos vectores virales y no virales están disponibles para la terapia génica; sin embargo, los vectores AAV son de gran interés debido a su excelente perfil de seguridad. AAV es un virus de ADN pequeño, monocatenario y sin envoltura que fue descubierto inicialmente como contaminante de una preparación de adenovirus en 1965 por Atchison et al.5,6 AAV fue posteriormente diseñado como un vector viral eficiente para la entrega de genes en la década de 1980 y se ha convertido en el vector de terapia génica de elección para muchas enfermedades, incluidos los trastornos oculares. en las últimas décadas. El más notable de ellos es el primer fármaco de terapia génica disponible comercialmente, voretigene neparvovec, que fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para tratar la amaurosis congénita de Leber, una rara enfermedad ocular posterior. Aunque voretigene neparvovec ha superado con éxito las barreras para el desarrollo clínico, sigue habiendo desafíos para la comercialización de terapias génicas oculares adicionales. Por ejemplo, voretigene neparvovec se administra a pacientes que retienen células retinianas viables mediante inyección subretiniana. Por lo tanto, los pacientes con formas más avanzadas de la enfermedad que carecen de células retinianas viables no son elegibles para el tratamiento, ya que no proporcionaría ningún beneficio clínico. Además, se observaron complicaciones conocidas asociadas con el procedimiento de inyección subretiniana, incluyendo inflamación ocular, cataratas, lagrimeo retiniano, maculopatía y dolor 7,8. Otras preocupaciones relacionadas con este procedimiento incluyen la posibilidad de hemorragia, desprendimiento de retina, endoftalmitis y revocación del estado inmune privilegiado ocular a través de la destrucción del tejido ocular 9,10,11,12. Por lo tanto, los esfuerzos para explorar rutas de administración de genes menos invasivas, como la inyección de SCJ, se han vuelto cada vez más importantes 13,14,15,16,17.
La conjuntiva es una membrana delgada que contiene 3-5 capas de células y conecta el ojo anterior con el párpado interior. Las inyecciones de SCJ se utilizan clínicamente para la administración de fármacos oftálmicos a los segmentos anterior y/o posterior del ojo para el tratamiento de enfermedades oculares como la degeneración macular asociada a la edad, glaucoma, retinitis y uveítis posterior18,19. Son relativamente simples de realizar, empleados rutinariamente para la administración de fármacos oftálmicos en un entorno ambulatorio20, algo indoloros, no comprometen el privilegio inmune ocular y permiten que los fármacos administrados se propaguen a través de una gran región periorbitaria que abarca el nervio óptico. Por lo tanto, las inyecciones de SCJ son una vía de administración atractiva para las aplicaciones de terapia génica AAV. Los serotipos naturales de AAV administrados mediante inyección de SCJ en ratones han sido previamente caracterizados por su seguridad, eficiencia de transducción, inmunogenicidad sérica, biodistribución y especificidad tisular13,16,21. Estos datos demostraron que la administración de genes a tejidos oculares individuales a través de la administración de SCJ es una posibilidad formal.
Este documento describe un protocolo simple y adaptable para la inyección de SCJ para entregar vectores AAV en un modelo de ratón. Para garantizar la reproducibilidad de este enfoque, se describe un sistema de inyección que consiste en un estereomicroscopio, una bomba de jeringa de infusión/extracción programable (que permite una velocidad y presión de inyección consistentes y precisas) y una jeringa extraíble hermética al gas junto con agujas de microinyección. Este sistema es adaptable para otras vías de administración intraocular como inyecciones intraestromales, intracamerales, intravítreas y subretinianas en animales pequeños. Además, a menudo se utiliza un tinte fluoresceína para permitir la visualización del sitio de inyección de AAV. Los pasos prácticos clave en la ruta de administración, la configuración de la plataforma de inyección, la preparación de la inyección y los consejos de la experiencia directa se discutirán en detalle. Finalmente, se discutirán brevemente las técnicas de validación comunes para la confirmación de la administración de AAV a los tejidos deseados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Las enfermedades oculares incluyen una amplia gama de trastornos genéticos y adquiridos hereditarios que son objetivos atractivos para la administración local de fármacos debido a su relativa facilidad de acceso a través de múltiples vías de administración. Las inyecciones subconjuntivales (SCJ) ofrecen ventajas sobre otras vías de administración intraocular, ya que son simples, seguras y generalmente se realizan en un entorno ambulatorio. Las inyecciones de SCJ en animales pequeños generalmente requieren la asistencia de un microscopio quirúrgico debido al tamaño del ojo. Trabajos previos han demostrado que la inyección SCJ de serotipos específicos de virus adenoasociados (AAV) es una estrategia válida de administración de genes para la transducción dirigida de la superficie ocular, el músculo ocular, la córnea y el nervio óptico, proporcionando un enfoque potencial para el tratamiento de muchas enfermedades oculares.
En este documento, se presenta un protocolo detallado para las inyecciones de SCJ en un modelo de ratón utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción programable (que permite una velocidad y presión de inyección consistentes y precisas) y una jeringa extraíble hermética al gas junto con agujas de microinyección. El sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular, como inyecciones intrastromales, intracamerales, intravítreas y subretinianas en animales pequeños. Aunque se describe la administración de vectores virales adenoasociados para estudios de terapia génica ocular, el protocolo aquí incluido también se puede adaptar para una variedad de soluciones oftálmicas en modelos de animales pequeños. Los pasos prácticos clave en la ruta de administración, la configuración de la plataforma de inyección, la preparación de la inyección y los consejos de la experiencia directa se discutirán en detalle. Además, también se discutirán brevemente las técnicas comunes de validación para la confirmación de la entrega de AAV a los tejidos deseados.

La solución inyectada en el espacio subconjuntival se presenta como una ampolla dependiendo del volumen de inyección. En este experimento, 7 μL de AAV (7 × 109 genomas virales (vg)/ojo) mezclados con fluoresceína a una concentración final de 0,1% se inyectaron con una aguja de 36 G bajo un microscopio estereoscópico, y la velocidad/presión de inyección se mantuvo constante utilizando una bomba de jeringa programable a 1 μL/s. Puede aparecer una ampolla al inyectarse (flecha). En l...

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Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.

Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Este protocolo ofrece un método de administración de terapia génica a múltiples tejidos oculares de una manera segura, fácil y efectiva. También es adaptable para inyecciones intraestromales y subretinianas en animales pequeños. El uso de la vía subconjuntival de inyección es mínimamente invasivo.Presenta menos riesgos y es muy prometedor para la administración AV para tratar múltiples enfermedades oculares. Con más de 1.000 millones de personas en todo el mundo que sufren de discapacidad visual, el uso de un método seguro y fácil para la administración de medicamentos ofrece una amplia aplicabilidad para el tratamiento de muchas causas diferentes de ceguera. Los métodos de administración de genes descritos en este protocolo son de particular interés para aquellos que están desarrollando posibles estrategias de intervención y oftalmólogos en ejercicio, que eventualmente administrarán estos medicamentos a los pacientes.El mayor desafío para alguien que está realizando este protocolo por primera vez es probablemente la inserción de la aguja en el concepto de espacio conjuntival. Para comenzar, ensamble el sistema de inyección colocando un microscopio estereoscópico y una bomba de jeringa en un gabinete de bioseguridad. A continuación, corte el tubo de polietileno a una longitud de aproximadamente 50 centímetros.Inserte el extremo de una aguja de calibre 36 en un extremo del tubo. Luego llene una jeringa desechable de 3 mililitros con agua estéril e insértela en el lado del tubo opuesto a la aguja. Enjuague el tubo tres veces, alternando entre agua estéril y alcohol al 70% para desinfectar el tubo y asegurarse de que no haya fugas, obstrucciones o daños en todo el tubo.Usando la jeringa desechable de 3 mililitros, llene el tubo con agua estéril y deje el tubo conectado a la jeringa desechable. Luego coloque un trozo de espuma de paracho en la superficie del gabinete de bioseguridad y agréguele un charco de agua estéril. Sumerja la porción del tubo conectada a la aguja en el charco de agua estéril.A continuación, saque la jeringa desechable de la abertura del tubo para evitar que entre aire en el sistema de tubos al retirar la jeringa. Luego llene una jeringa Hamilton de 10 microlitros con agua estéril. A continuación, conecte la aguja de la jeringa Hamilton al extremo abierto del tubo sumergiendo la punta de la aguja de la jeringa Hamilton en el charco de agua estéril en la película para.Mantenga presionado el botón de retroceso rápido en la pantalla de la bomba para mover los bloques del empujador a la longitud aproximada de la jeringa. A continuación, desenrosque las perillas de sujeción del soporte para aflojar los soportes de retención en el empujador y los bloques del soporte de la jeringa. Posteriormente, cargue la jeringa Hamilton en el bloque del soporte de la jeringa y asegure la jeringa siguiendo las instrucciones del fabricante.Para ajustar los parámetros en la pantalla de configuración de la bomba, presione el botón "Forzar" y establezca el nivel de fuerza en 30%Luego acepte los cambios para volver a la pantalla de configuración. Presione el botón "Inicio rápido", seleccione Método y, a continuación, seleccione la opción Sólo infundir. Para la opción de jeringa, seleccione Hamilton 1700, luego haga clic en "Vidrio" y seleccione 10 microlitros.Más tarde, seleccione la velocidad de infusión y el volumen de inyección. Expulse el agua de la jeringa Hamilton mientras deja el tubo y la aguja de inyección llenos de agua presionando el botón Infuse". A continuación, retire el virus colocando la aguja de inyección en una alícuota de la cepa de virus.Luego, tire ligeramente hacia atrás de la jeringa Hamilton presionando el botón de retroceso para introducir una pequeña burbuja de aire en el tubo. Después de anestesiar al animal, agarre la conjuntiva con fórceps. Luego inserte la aguja en la conjuntiva hasta que el bisel esté completamente cubierto por la membrana conjuntival, y coloque la aguja contra el globo.Simultáneamente, inicie la inyección presionando el botón "Start" con el interruptor de pie. Para examinar la distribución del vector AAV, los tejidos oculares y circundantes se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones sagitales representativas demostraron que la dispersión de la tinta china se produjo principalmente adyacente a los músculos extraoculares en la superficie externa de la esclerótica en los tejidos conectivos sueltos perioculares.Para confirmar la transducción de AAV 8 autocomplementario a las ocho semanas después de la inyección, se examinó la abundancia de proteína de fluorescencia verde en las secciones transversales mediante tinción de inmunofluorescencia. Los resultados revelaron que los vectores AAV 8 transducieron eficientemente los músculos perioculares posteriores al ojo y la córnea. Para analizar la biodistribución del vector, se examinaron los números de copias del genoma del vector y los distintos compartimentos oculares en otros órganos, incluidos el hígado y el corazón, mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa utilizando cebadores y sondas específicas para el transgén.La expresión del transgén se confirmó mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, que sugirió que la inyección subconjuntival de AAV 8 da como resultado la expresión transgénica en el párpado, la conjuntiva, la córnea y el nervio óptico. La burbuja de aire servirá como una barrera entre el agua en el tubo y el medicamento terapéutico. Esta técnica permite a otros investigadores explorar el uso de la vía de administración subconjuntival tanto para soluciones oftálmicas como para terapias génicas oculares para múltiples enfermedades.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores

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Investigación

Medicina

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

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An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

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Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

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Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

El muestreo sanguíneo continuo en tomografía por emisión de positrones de animales pequeños permite la medición de la función de entrada arterial

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