Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Författarna tackar Vector Core vid University of North Carolina för att ha tillhandahållit scAAV8-GFP-vektorerna som används i denna studie, CGIBD Histology Core och laboratoriet för Dr. Brian C. Gilger för deras hjälp med de kliniska bedömningsaspekterna av denna studie. Denna studie stöddes av Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship och ett karriärutvecklingspris från American Society of Gene & Cell Therapy och Cystic Fibrosis Foundation. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från American Society of Gene & Cell Therapy eller Cystic Fibrosis Foundation.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med bestämmelserna från Institutional Animal Care and Use Committee vid University of North Carolina at Chapel Hill. Användningen av AAV-vektorer är en biosäkerhetsnivå 1-risk för biohazard. Använd korrekt personlig skyddsutrustning, inklusive en labbrock, handskar och skyddsglasögon vid hantering av AAV. För experimentet som beskrivs häri användes en rekombinant AAV-vektor förpackad med serotyp 8-kapsiden och kodning av en generisk allestädes närvarande cytomegalovir...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

AAV-medierad genterapi har stor potential för behandling av ögonsjukdomar. Nuvarande okulär genterapi är beroende av två stora lokala administreringsvägar, intravitreala och subretinala injektioner. Tyvärr är båda vägarna invasiva och kan orsaka allvarliga komplikationer, inklusive näthinneavlossning, kataraktbildning och endoftalmit. Således är undersökningen av relativt mindre invasiva vägar, såsom SCJ-injektion, av stort intresse.
Även om denna teknik är relativt enkel och...

Ögonsjukdomar omfattar ett brett spektrum av både genetiska och förvärvade störningar. År 2015 var uppskattningsvis 36 miljoner människor juridiskt blinda över hela världen, och över 1 miljard människor lider av åtminstone någon nivå av synnedsättning, vilket belyser behovet av att öka hjälpinsatserna på alla nivåer1. De viktigaste metoderna för att leverera okulära läkemedel inkluderar både topisk och lokal administrering, såsom ögondroppar eller subkonjunktival (SCJ), intrakameral, intravitreala och subretinala injektioner. Även om icke-invasiv topisk terapi är den vanligaste leveransmetoden för oftalmiska läkemedel och används i stor utsträckning för många främre segmentstörningar, utgör förekomsten av hornhinnans anatomiska barriärer en utmaning för biotillgängligheten, biodistributionen och effekten av lokalt administrerade ämnen, vilket tyder på att det kanske inte är den bästa kandidatbehandlingsvägen för många sjukdomar i det inre ögat. Lokal injektion i det specifika okulära facket som påverkas av sjukdomen är sannolikt en mer effektiv och riktad läkemedelsleveransmetod2. Emellertid, biverkningar till följd av upprepade injektioner kan komplicera administreringsstrategier. Helst bör en terapi upprätthålla långsiktig terapeutisk effekt efter en enda administrering. Således är genterapi ett lovande alternativ för att minimera antalet nödvändiga injektioner och tillhandahålla ihållande transgenuttryck för behandling av okulär sjukdom 3,4.
Många virala och icke-virala vektorer är tillgängliga för genterapi; AAV-vektorer är dock av stort intresse på grund av deras utmärkta säkerhetsprofil. AAV är ett litet, enkelsträngat, icke-omslutet DNA-virus som ursprungligen upptäcktes som en förorening av ett adenoviruspreparat 1965 av Atchison et al.5,6 AAV konstruerades därefter som en effektiv viral vektor för genleverans på 1980-talet och har blivit den valda genterapivektorn för många sjukdomar, inklusive okulära störningar, under de senaste decennierna. Den mest anmärkningsvärda av dessa är det första kommersiellt tillgängliga genterapiläkemedlet, voretigene neparvovec, som godkändes av United States Food and Drug Administration för att behandla Lebers medfödda amauros, en sällsynt bakre ögonsjukdom. Även om voretigene neparvovec framgångsrikt har övervunnit hinder för klinisk utveckling, kvarstår utmaningar för kommersialiseringen av ytterligare okulära genterapier. Till exempel administreras voretigene neparvovec till patienter som behåller livskraftiga retinala celler via subretinal injektion. Således är patienter med mer avancerade former av sjukdomen som saknar livskraftiga retinala celler inte berättigade till behandling, eftersom det inte skulle ge någon klinisk nytta. Dessutom observerades kända komplikationer i samband med subretinal injektionsprocedur, inklusive ögoninflammation, grå starr, retinal rivning, makulopati och smärta 7,8. Andra problem relaterade till detta förfarande inkluderar möjligheten till blödning, retinalavskiljning, endoftalmitis och återkallande av ögonimmun privilegierad status genom ögonvävnadsförstöring 9,10,11,12. Således har ansträngningar för att utforska mindre invasiva genleveransvägar som SCJ-injektion blivit allt viktigare 13,14,15,16,17.
Konjunktiva är ett tunt membran som innehåller 3-5 lager celler och förbinder det främre ögat med det inre ögonlocket. SCJ-injektioner används kliniskt för oftalmisk läkemedelstillförsel till både de främre och / eller bakre segmenten av ögat för behandling av ögonsjukdomar såsom åldersrelaterad makuladegeneration, glaukom, retinit och bakre uveit18,19. De är relativt enkla att utföra, används rutinmässigt för oftalmisk läkemedelsleverans i en öppenvårdsmiljö20, något smärtfri, äventyrar inte okulärt immunprivilegium och tillåter administrerade läkemedel att spridas genom en stor periorbital region som omfattar synnerven. Därför är SCJ-injektioner en attraktiv administreringsväg för AAV-genterapiapplikationer. Naturliga AAV-serotyper administrerade via SCJ-injektion i möss har tidigare karakteriserats för säkerhet, transduktionseffektivitet, serumimmunogenicitet, biodistribution och vävnadsspecificitet13,16,21. Dessa data visade att genleverans till enskilda okulära vävnader via SCJ-administrering är en formell möjlighet.
Detta dokument beskriver ett enkelt och anpassningsbart protokoll för SCJ-injektion för att leverera AAV-vektorer i en musmodell. För att säkerställa reproducerbarheten av detta tillvägagångssätt beskrivs ett injektionssystem bestående av ett stereomikroskop, en programmerbar infusions-/abstinenssprutpump (som möjliggör konsekvent och exakt injektionshastighet och tryck) och en gastät avtagbar spruta i kombination med mikroinjektionsnålar. Detta system är anpassningsbart för andra intraokulära administreringsvägar såsom intrastromala, intrakamerala, intravitreala och subretinala injektioner hos små djur. Dessutom används ofta ett fluoresceinfärgämne för att möjliggöra visualisering av AAV-injektionsstället. De viktigaste praktiska stegen i administreringsvägen, installationen för injektionsplattformen, beredningen av injektionen och tips från direkt erfarenhet kommer att diskuteras i detalj. Slutligen kommer vanliga valideringstekniker för bekräftelse av AAV-leverans till önskade vävnader att diskuteras kortfattat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Okulära sjukdomar inkluderar ett brett spektrum av ärftliga genetiska och förvärvade störningar som är tilltalande mål för lokal läkemedelsleverans på grund av deras relativa lättillgänglighet via flera administreringsvägar. Subkonjunktival (SCJ) injektioner erbjuder fördelar jämfört med andra intraokulära administreringsvägar eftersom de är enkla, säkra och vanligtvis utförs i en poliklinisk miljö. SCJ-injektioner hos små djur kräver vanligtvis hjälp av ett operativt mikroskop på grund av ögats storlek. Tidigare arbete har visat att SCJ-injektion av specifika adenoassocierade virus (AAV) serotyper är en giltig genleveransstrategi för riktad transduktion av ögonytan, ögonmuskeln, hornhinnan och synnerven, vilket ger ett potentiellt tillvägagångssätt för behandling av många ögonsjukdomar.
Häri presenteras ett detaljerat protokoll för SCJ-injektioner i en musmodell med hjälp av ett injektionssystem bestående av en programmerbar infusions-/abstinenssprutpump (vilket möjliggör konsekvent och exakt injektionshastighet och tryck) och en gastät avtagbar spruta i kombination med mikroinjektionsnålar. Injektionssystemet är också anpassningsbart för andra intraokulära administreringsvägar såsom intrastromala, intrakamerala, intravitreala och subretinala injektioner hos små djur. Även om leveransen av adenoassocierade virusvektorer för okulära genterapistudier beskrivs, kan protokollet häri också anpassas för en mängd olika oftalmiska lösningar i smådjursmodeller. De viktigaste praktiska stegen i administreringsvägen, installationen för injektionsplattformen, beredningen av injektionen och tips från direkt erfarenhet kommer att diskuteras i detalj. Dessutom kommer vanliga valideringstekniker för AAV-leveransbekräftelse till önskade vävnader också att diskuteras kortfattat.

Lösning som injiceras i subkonjunktivalutrymmet presenteras som en bleb beroende på injektionsvolymen. I detta experiment injicerades 7 μL AAV (7 × 109 virala genom (vg)/öga) blandat med fluorescein i en slutlig koncentration av 0,1% med en 36 G-nål under ett stereomikroskop, och injektionshastigheten/trycket hölls konstant med hjälp av en programmerbar sprutpump vid 1 μL/s. En bleb kan visas vid injektion (pil). En mikroskopisk vy av administrering av AAV-vektorer till det murina ...

Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

I detta manuskript demonstreras subkonjunktival injektion som en giltig vektortillförselmetod för ögonvävnader hos möss med hjälp av ett injektionssystem bestående av en infusions-/abstinenssprutpump och en gastät avtagbar spruta i kombination med mikroinjektionsnålar. Detta injektionssystem är också anpassningsbart för andra intraokulära administreringsvägar.

Subkonjunktival administrering av adenoassocierade virusvektorer i smådjursmodeller

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Detta protokoll erbjuder en metod för genterapileverans till flera okulära vävnader på ett säkert, enkelt och effektivt sätt. Det är också anpassningsbart för intrastromala och subretinala injektioner hos små djur. Användning av subkonjunktival injektionsväg är minimal invasiv.Det innebär färre risker och har stort löfte för AV-leverans för att behandla flera okulära sjukdomar. Med över 1 miljard människor världen över som lider av synnedsättning, erbjuder användning av en säker och enkel metod för läkemedelsleverans bred tillämpbarhet för behandling av många olika orsaker till blindhet. Genleveransmetoderna som beskrivs i detta protokoll är av särskilt intresse för dem som utvecklar potentiella interventionsstrategier och praktiserar ögonläkare, som så småningom kommer att leverera dessa läkemedel till patienter.Den största utmaningen för någon som utför detta protokoll för första gången är sannolikt införandet av nålen i konceptkonjunktivalutrymmet. För att börja, montera injektionssystemet genom att placera ett stereomikroskop och en sprutpump i ett biosäkerhetsskåp. Skär sedan polyetenröret till en längd av cirka 50 centimeter.För in änden på en 36-gauge nål i ena änden av slangen. Fyll sedan en engångsspruta på 3 ml med sterilt vatten och sätt in den i rörets sida mittemot nålen. Spola slangen tre gånger, växla mellan sterilt vatten och 70% alkohol för att desinficera slangen och se till att det inte finns några läckor, träskor eller skador i hela slangen.Använd engångssprutan på 3 ml och fyll slangen med sterilt vatten och låt slangen fästas på engångssprutan. Placera sedan en bit parafoam på ytan av biosäkerhetsskåpet och tillsätt en pool med sterilt vatten till det. Sänk ner den del av slangen som är ansluten till nålen i poolen med sterilt vatten.Dra sedan ut engångssprutan från röröppningen för att förhindra att luft tränger in i slangsystemet när sprutan tas bort. Fyll sedan en 10-mikroliter Hamilton-spruta med sterilt vatten. Anslut sedan Hamilton-sprutnålen till slangens öppna ände genom att sänka ner nålspetsen på Hamilton-sprutan i poolen med sterilt vatten på parafilmen.Håll den snabba bakåtknappen på pumpskärmen intryckt för att flytta tryckblocken till sprutans ungefärliga längd. Skruva sedan loss fästets klämknappar för att lossa fästfästena på påskjutaren och spruthållarblocken. Ladda därefter Hamilton-sprutan på spruthållarblocket och säkra sprutan enligt tillverkarens instruktioner.För att justera parametrarna på pumpinställningsskärmen, tryck på Force "-knappen och ställ in kraftnivån på 30% Acceptera sedan ändringarna för att gå tillbaka till inställningsskärmen. Tryck på knappen Snabbstart", välj Metod och välj sedan alternativet Endast infundera". För sprutalternativet, välj Hamilton 1700, klicka sedan på Glas"och välj 10 mikroliter.Senare väljer du infusionshastigheten och injektionsvolymen. Mata ut vattnet från Hamilton-sprutan medan du lämnar slangen och injektionsnålen full av vatten genom att trycka på Infuse"-knappen. Dra sedan tillbaka viruset genom att placera injektionsnålen i en alikvot av virusbeståndet.Dra sedan tillbaka Hamilton-sprutan något genom att trycka på bakåtknappen för att införa en liten luftbubbla i slangen. Efter bedövning av djuret, ta tag i konjunktiva med pincett. För sedan in nålen i konjunktiva tills avfasningen är helt täckt av konjunktivalmembranet och lägg nålen mot jordklotet.Starta samtidigt injektionen genom att trycka på Start"-knappen med fotomkopplaren. För att undersöka fördelningen av AAV-vektorn färgades de okulära och omgivande vävnaderna med hematoxylin och eosin. De representativa sagittala sektionerna visade att dispersionen av indiskt bläck inträffade huvudsakligen intill de extraokulära musklerna i den yttre ytan av sclera i de periokulära lösa bindväven.För att bekräfta transduktion av självkompletterande AAV 8 vid åtta veckor efter injektionen undersöktes grönt fluorescensproteinförekomst i tvärsnitten genom immunofluorescensfärgning. Resultaten avslöjade att AAV 8-vektorer effektivt transducerade de periokulära musklerna bakom ögat och hornhinnan. För att analysera vektorbiofördelningen undersöktes vektorgenomkopienummer och distinkta ögonfack i andra organ, inklusive lever och hjärta, genom kvantitativ polymeraskedjereaktion med hjälp av primers och sonder som är specifika för transgenen.Uttrycket av transgenen bekräftades genom kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion, vilket föreslog att subkonjunktivalinjektionen av AAV 8 resulterar i transgenuttryck i ögonlocket, konjunktiva, hornhinnan och optisk nerv. Luftbubblan kommer att fungera som en barriär mellan vattnet i röret och det terapeutiska läkemedlet. Denna teknik gör det möjligt för andra forskare att utforska användningen av den subkonjunktivala administreringsvägen för både oftalmiska lösningar och okulära genterapier för flera sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Högeffektiva Transduction Celler Levercancer med rekombinant Adeno-associerad serotyp 3 Vektorer

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protokoll för Långtidskurser Whole Body hypertermi hos möss

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

En isolerad Working Heart System för stora djurmodeller

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Använda adenoassocierat virus som ett verktyg för att studera Retinal Hinder i Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Högfrekvent ultraljud avbildning av Mouse Cervical lymfkörtlar

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Utvärdering av fraktur förhårdnader utveckling under läkning hos möss med en MRI-kompatibel osteosyntes enhet för mus lårbenet

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten djurmodell för Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Adeno-associerade Virus-medierad leverans av CRISPR för hjärt gen redigering i möss

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

Kontinuerlig blodprovstagning i små djur positron emissions tomografi/datortomografi möjliggör mätning av arteriell input funktion

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...