Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan scAAV8-GFP vektörlerini, CGIBD Histoloji Çekirdeğini ve Dr. Brian C. Gilger'in laboratuvarını bu çalışmanın klinik değerlendirme yönleriyle ilgili yardımları için sağladıkları için Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Vector Core'a teşekkür eder. Bu çalışma, Pfizer-NC Biotech Seçkin Doktora Sonrası Bursu ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği ve Kistik Fibroz Vakfı'ndan Kariyer Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği veya Kistik Fibroz Vakfı'nın resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Tüm hayvan prosedürleri, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirildi. AAV vektörlerinin kullanımı Biyogüvenlik Seviye 1 biyolojik tehlike riskidir. AAV'yi kullanırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Burada açıklanan deney için, serotip 8 kapsid ile paketlenmiş ve yeşil floresan proteininin (GFP) ekspresyonunu kontrol eden jenerik bi...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

AAV aracılı gen tedavisi, oküler hastalıkların tedavisinde büyük potansiyele sahiptir. Günümüzde oküler gen tedavisi intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar olmak üzere iki ana lokal uygulama yoluna dayanmaktadır. Ne yazık ki, her iki yol da invazivdir ve retina dekolmanı, katarakt oluşumu ve endoftalmi gibi ciddi komplikasyonlara neden olabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi nispeten daha az invaziv yolların araştırılması büyük ilgi çekicidir.
Bu teknik nispeten ba...

Oküler hastalıklar hem genetik hem de edinsel bozuklukların geniş bir yelpazesini kapsar. 2015 yılında, dünya çapında tahmini 36 milyon insan yasal olarak kördü ve 1 milyardan fazla insan en azından bir miktar görme bozukluğundan muzdaripti ve bu da hafifletme çabalarını her seviyede ölçeklendirme ihtiyacını vurguladı1. Oküler ilaçların verilmesi için ana yöntemler, göz damlası veya subkonjonktival (SCJ), intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi hem topikal hem de lokal uygulamayı içerir. Noninvaziv topikal tedavi oftalmik ilaçlar için en yaygın dağıtım yöntemi olmasına ve birçok ön segment bozukluğunda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kornea anatomik bariyerlerinin varlığı, topikal olarak uygulanan maddelerin biyoyararlanımı, biyodağılımı ve etkinliği için bir zorluk teşkil etmekte ve bu da iç gözün birçok hastalığı için en iyi aday tedavi yolu olmayabileceğini düşündürmektedir. Hastalıktan etkilenen spesifik oküler kompartmana lokal enjeksiyonun daha etkili ve hedefe yönelik bir ilaç dağıtım yaklaşımı olması muhtemeldir2. Bununla birlikte, tekrarlanan enjeksiyonlardan kaynaklanan olumsuz etkiler uygulama stratejilerini karmaşıklaştırabilir. İdeal olarak, bir terapi tek bir uygulamayı takiben uzun süreli terapötik etkinliği korumalıdır. Bu nedenle, gen tedavisi, gerekli enjeksiyon sayısını en aza indirmek ve oküler hastalığın tedavisi için sürekli transgen ekspresyonu sağlamak için umut verici bir seçenektir 3,4.
Gen tedavisi için çok sayıda viral ve viral olmayan vektör mevcuttur; Bununla birlikte, AAV vektörleri mükemmel güvenlik profilleri nedeniyle yüksek ilgi görmektedir. AAV, başlangıçta 1965 yılında Atchison ve ark. tarafından bir adenovirüs preparatının kirleticisi olarak keşfedilen küçük, tek sarmallı, zarfsız bir DNA virüsüdür.5,6 AAV daha sonra 1980'lerde gen iletimi için etkili bir viral vektör olarak tasarlanmış ve oküler bozukluklar da dahil olmak üzere birçok hastalık için tercih edilen gen terapisi vektörü haline gelmiştir. son birkaç on yılda. Bunlardan en önemlisi, nadir görülen bir arka göz hastalığı olan Leber'in Konjenital Amaurosis'ini tedavi etmek için Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan ilk ticari olarak temin edilebilen gen terapisi ilacı voretigene neparvovec'tir. Voretigene neparvovec, klinik gelişimin önündeki engelleri başarıyla aşmış olsa da, ek oküler gen tedavilerinin ticarileştirilmesi için zorluklar devam etmektedir. Örneğin, voretigene neparvovec, subretinal enjeksiyon yoluyla canlı retinal hücreleri tutan hastalara uygulanır. Bu nedenle, canlı retinal hücrelerden yoksun olan hastalığın daha ileri formlarına sahip hastalar, klinik fayda sağlamayacağı için tedavi için uygun değildir. Ek olarak, göz iltihabı, katarakt, retina yırtılması, makülopati ve ağrı dahil olmak üzere subretinal enjeksiyon prosedürü ile ilişkili bilinen komplikasyonlar gözlenmiştir 7,8. Bu prosedürle ilgili diğer endişeler arasında kanama, retina dekolmanı, endoftalmi ve gözdokusu yıkımı yoluyla oküler immün ayrıcalıklı durumun iptal edilmesi olasılığı 9,10,11,12 sayılabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi daha az invaziv gen dağıtım yollarını keşfetme çabaları giderek daha önemli hale gelmiştir 13,14,15,16,17.
Konjonktiva, 3-5 kat hücre içeren ve ön gözü iç göz kapağına bağlayan ince bir zardır. SCJ enjeksiyonları klinik olarak yaşa bağlı makula dejenerasyonu, glokom, retinit ve posterior üveit gibi oküler hastalıkların tedavisinde gözün hem ön hem de / veya arka segmentlerine oftalmik ilaç verilmesi için kullanılır18,19. Uygulanması nispeten basittir, ayaktantedavi ortamında oftalmik ilaç dağıtımı için rutin olarak kullanılırlar, biraz ağrısızdırlar, oküler immün ayrıcalıktan ödün vermezler ve uygulanan ilaçların optik siniri kapsayan geniş bir periorbital bölgeye yayılmasına izin verirler. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonları AAV gen terapisi uygulamaları için cazip bir uygulama yoludur. Farelerde SCJ enjeksiyonu ile uygulanan doğal AAV serotipleri daha önce güvenlik, transdüksiyon etkinliği, serum immünojenisitesi, biyodağılım ve doku özgüllüğü 13,16,21 ile karakterize edilmiştir. Bu veriler, SCJ uygulaması yoluyla bireysel oküler dokulara gen iletiminin resmi bir olasılık olduğunu göstermiştir.
Bu yazıda, bir fare modelinde AAV vektörleri sunmak için SCJ enjeksiyonu için basit ve uyarlanabilir bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşımın tekrarlanabilirliğini sağlamak için, bir stereomikroskop, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompası (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncı sağlayan) ve mikroenjeksiyon iğneleri ile birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Bu sistem, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için uyarlanabilir. Ek olarak, AAV enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesine izin vermek için sıklıkla bir floresein boyası kullanılır. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Son olarak, istenen dokulara AAV iletiminin doğrulanması için yaygın validasyon teknikleri kısaca tartışılacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Oküler hastalıklar, çoklu uygulama yolları üzerinden göreceli olarak erişilebilirliklerinin kolaylığı nedeniyle lokal ilaç dağıtımı için cazip hedefler olan çok çeşitli kalıtsal genetik ve edinsel bozuklukları içerir. Subkonjonktival (SCJ) enjeksiyonlar, basit, güvenli ve genellikle ayakta tedavi ortamında gerçekleştirildikleri için diğer göz içi uygulama yollarına göre avantajlar sunar. Küçük hayvanlarda SCJ enjeksiyonları genellikle gözün büyüklüğü nedeniyle ameliyat mikroskobunun yardımını gerektirir. Önceki çalışmalar, spesifik adeno ilişkili virüs (AAV) serotiplerinin SCJ enjeksiyonunun, oküler yüzeyin, göz kasının ve optik sinirin hedeflenen transdüksiyonu için geçerli bir gen dağıtım stratejisi olduğunu ve birçok oküler hastalığın tedavisi için potansiyel bir yaklaşım sağladığını göstermiştir.
Burada, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompasından (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncına izin veren) ve mikroenjeksiyon iğneleriyle birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak bir fare modelinde SCJ enjeksiyonları için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Enjeksiyon sistemi, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir. Oküler gen terapisi çalışmaları için adeno ilişkili viral vektörlerin verilmesi tarif edilmesine rağmen, buradaki protokol küçük hayvan modellerinde çeşitli oftalmik çözeltiler için de uyarlanabilir. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Ek olarak, istenen dokulara AAV doğum onayı için yaygın doğrulama teknikleri de kısaca tartışılacaktır.

Subkonjonktival boşluğa enjekte edilen çözelti, enjeksiyon hacmine bağlı olarak bir bleb olarak ortaya çıkar. Bu deneyde,% 0.1'lik son konsantrasyonda floresein ile karıştırılmış 7 μL AAV (7 × 109 viral genom (vg) / göz), stereomikroskop altında 36 G'lik bir iğne ile enjekte edildi ve enjeksiyon hızı / basıncı, 1 μL / s'de programlanabilir bir şırınga pompası kullanılarak sabit tutuldu. Enjeksiyon sırasında bir bleb görünebilir (ok). Murin SCJ bölmesine AAV...

Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Bu yazıda, subkonjonktival enjeksiyon, mikroenjeksiyon iğneleri ile birlikte infüzyon/geri çekilme şırınga pompası ve gaz geçirmez çıkarılabilir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak farelerde oküler dokular için geçerli bir vektör dağıtım yöntemi olarak gösterilmiştir. Bu enjeksiyon sistemi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir.

Küçük Hayvan Modellerinde Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Subkonjonktival Uygulaması

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Bu protokol, çoklu oküler dokulara güvenli, kolay ve etkili bir şekilde gen terapisi verilmesi için bir yöntem sunar. Ayrıca küçük hayvanlarda intrastromal ve subretinal enjeksiyonlar için uyarlanabilir. Subkonjonktival enjeksiyon yolunun kullanımı minimal invazivdir.Daha az risk oluşturur ve çoklu oküler hastalıkları tedavi etmek için AV dağıtımı için büyük umut vaat eder. Dünya çapında görme bozukluğundan muzdarip 1 milyardan fazla insanla, ilaç dağıtımı için güvenli ve kolay bir yöntem kullanmak, körlüğün birçok farklı nedeninin tedavisi için geniş uygulanabilirlik sunmaktadır. Bu protokolde açıklanan gen dağıtım yöntemleri, potansiyel müdahale stratejileri geliştiren ve sonunda bu ilaçları hastalara ulaştıracak olan göz doktorlarını uygulayanlar için özellikle ilgi çekicidir.Bu protokolü ilk kez gerçekleştiren biri için en büyük zorluk, muhtemelen iğnenin kavram konjonktival boşluğuna sokulmasıdır. Başlamak için, bir biyo-güvenlik kabinine bir stereo mikroskop ve bir şırınga pompası yerleştirerek enjeksiyon sistemini monte edin. Daha sonra, polietilen boruyu yaklaşık 50 santimetre uzunluğa kadar kesin.36 gauge'lik bir iğnenin ucunu borunun bir ucuna yerleştirin. Daha sonra tek kullanımlık 3 mililitrelik bir şırıngayı steril suyla doldurun ve iğnenin karşısındaki tüpün yanına yerleştirin. Boruyu dezenfekte etmek ve boru boyunca sızıntı, tıkanma veya hasar olmadığından emin olmak için steril su ve% 70 alkol arasında geçiş yaparak boruyu üç kez yıkayın.Tek kullanımlık 3 mililitrelik şırıngayı kullanarak, boruyu steril suyla doldurun ve boruyu tek kullanımlık şırıngaya bağlı bırakın. Daha sonra biyo-güvenlik kabininin yüzeyine bir parça parafoam yerleştirin ve üzerine bir steril su havuzu ekleyin. İğneye bağlı borunun bir kısmını steril su havuzuna batırın.Daha sonra, şırınganın çıkarılmasından sonra herhangi bir havanın boru sistemine girmesini önlemek için tek kullanımlık şırıngayı tüp açıklığından dışarı çekin. Ardından 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasını steril suyla doldurun. Daha sonra, Hamilton şırıngasının iğne ucunu para filmi üzerindeki steril su havuzuna batırarak Hamilton şırınga iğnesini borunun açık ucuna bağlayın.İtici blokları şırınganın yaklaşık uzunluğuna taşımak için pompa ekranındaki hızlı geri vites düğmesini basılı tutun. Ardından, itici üzerindeki tutucu braketleri ve şırınga tutucu bloklarını gevşetmek için braket sıkma düğmelerini sökün. Daha sonra, Hamilton şırıngasını şırınga tutucu bloğuna yükleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek şırıngayı sabitleyin.Pompa ayarı ekranındaki parametreleri ayarlamak için "Kuvvet" düğmesine basın ve kuvvet seviyesini %30 olarak ayarlayın, ardından ayar ekranına geri dönmek için değişiklikleri kabul edin. Hızlı Başlat" düğmesine basın, Yöntem'i seçin ve ardından Yalnızca Demle" seçeneğini belirleyin. Şırınga seçeneği için Hamilton 1700'ü seçin, ardından Cam'a tıklayın ve 10 mikrolitre seçin.Daha sonra, infüzyon hızını ve enjeksiyon hacmini seçin. Suyu Hamilton şırıngasından çıkarın ve Demleyin" düğmesine basarak boru ve enjeksiyon iğnesini suyla dolu bırakın. Daha sonra, enjeksiyon iğnesini virüs stokunun bir aliquot'una yerleştirerek virüsü geri çekin.Ardından, boruya küçük bir hava kabarcığı sokmak için geri düğmesine basarak Hamilton şırıngasını hafifçe geri çekin. Hayvanı anestezi uyguladıktan sonra, konjonktivayı forseps ile tutun. Daha sonra konjonktiva içine konjonktiva içine konvokal konjonktiva içine yerleştirin ve iğneyi dünyaya karşı yerleştirin.Aynı anda, ayak düğmesini kullanarak Başlat düğmesine basarak enjeksiyonu başlatın. AAV vektörünün dağılımını incelemek için, oküler ve çevre dokular hematoksilin ve eozin ile boyandı. Temsili sagital bölümler, Hindistan mürekkebinin dağılımının esas olarak perioküler gevşek bağ dokularındaki skleranın dış yüzeyindeki ekstraoküler kaslara bitişik olarak gerçekleştiğini göstermiştir.Enjeksiyondan sekiz hafta sonra kendi kendini tamamlayan AAV 8'in transdüksiyonunu doğrulamak için, kesitlerdeki yeşil floresan protein bolluğu immünofloresan boyama ile incelendi. Sonuçlar, AAV 8 vektörlerinin perioküler kasları posterior olarak göze ve korneaya verimli bir şekilde dönüştürdüğünü ortaya koydu. Vektör biyo-dağılımını analiz etmek için, vektör genom kopya numaraları ve karaciğer ve kalp de dahil olmak üzere diğer organlardaki farklı göz bölmeleri, transgene özgü primerler ve problar kullanılarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ile incelendi.Transgenin ekspresyonu, AAV 8'in subkonjonktival enjeksiyonunun göz kapağında, konjonktivada, korneada ve optik sinirde transgen ekspresyonuyla sonuçlandığını öne süren kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile doğrulandı. Hava kabarcığı, tüpteki su ile terapötik ilaç arasında bir bariyer görevi görecektir. Bu teknik, diğer araştırmacıların hem oftalmik çözümler hem de çoklu hastalıklar için oküler gen terapileri için subkonjonktival uygulama yolunun kullanımını keşfetmelerini sağlar.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Rekombinant Adeno Associated Virus serotip 3 Vektörler Karaciğer Kanseri Hücreleri Yüksek Verimlilik İletimi

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Tıp

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Farelerde Uzun Süre Whole Body Hipertermi için protokol

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Büyük Hayvan Modelleri için bir İzole Çalışma Kalp Sistemi

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Fare Servikal lenf nodu Yüksek frekanslı Ultrasonik Görüntüleme

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Vivo Fare uyluk için bir MRI uyumlu Osteosentez aygıtı kullanma farelerde kemik iyileşme sırasında kırık Kallus gelişimi değerlendirme

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Ex Vivo Normothermic karaciğer perfüzyon küçük bir hayvan Model

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

Küçük hayvan Pozitron Emisyon Tomografi/Bilgisayarlı tomografi sürekli kan örnekleme arteriyel giriş fonksiyon ölçümü sağlar

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...