Name: atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots
Uploaded: 2022-03-31T13:50:00
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Cette recherche a été financée par CSIC I+D 2018, subvention n ° 95 (Mariana Sotelo Silveira). CSIC Grupos (Omar Borsani) et PEDECIBA.

1. Préparation du matériel végétal et conditions de croissance
<ol><li>Pour générer le matériel végétal nécessaire, stérilisez les graines de type sauvage d’Arabidopsis et les lignées mutantes d’intérêt. REMARQUE: Dans ce protocole, nous avons utilisé ce qui suit: ttl1: Lignes d’insertion de l’ADN-T Salk_063943 (pour TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) de type sauvage; le mutant Procuste1 (prc1-1), qui consiste en une mutation knock-out (Q...

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+instrument+to+standardise+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).</li><li>Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+elastic+modulus+and+hysteresis+of+skeletal+muscle+cells+throughout+differentiation.">Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).</li><li>Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. 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La mécanique des cellules et des parois cellulaires devient de plus en plus pertinente pour mieux comprendre comment la mécanique affecte les processus de croissance. Comme les forces physiques se propagent sur des distances considérables dans les tissus solides, l’étude des changements dans les propriétés physiques de la paroi cellulaire et comment ils sont détectés, contrôlés, réglés et impactent la croissance de la plante devient un domaine d’étude important <...

Les cellules végétales sont entourées d’une paroi cellulaire qui est une structure complexe composée de réseaux en interaction de polysaccharides, de protéines, de métabolites et d’eau dont l’épaisseur varie de 0,1 à plusieurs μm selon le type cellulaire et la phase de croissance 1,2. Les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire jouent un rôle essentiel dans la croissance des plantes. De faibles valeurs de rigidité de la paroi cellulaire ont été proposées comme condition préalable à la croissance cellulaire et à l’expansion de la paroi cellulaire, et il est de plus en plus évident que toutes les cellules détectent les forces mécaniques pour remplir leurs fonctions. Cependant, il est encore débattu si les changements dans les propriétés physiques de la paroi cellulaire déterminent le destin cellulaire 2,3,4. Parce que les cellules végétales ne bougent pas pendant le développement, la forme finale d’un organe dépend de la distance et de la direction dans laquelle une cellule se développe. Ainsi, la racine d’Arabidopsis est un bon modèle pour étudier l’impact des propriétés physiques de la paroi cellulaire dans l’expansion cellulaire, car différents types d’expansion se produisent dans différentes régions de la racine. Par exemple, l’expansion anisotrope est évidente dans la zone d’élongation et particulièrement perceptible dans les cellules épidermiques5.
La méthode décrite ici a été utilisée pour caractériser les propriétés physiques de la paroi cellulaire des cellules épidermiques à l’échelle nanométrique des racines vivantes d’Arabidopsis à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM) couplé à un microscope à phase de fluorescence inversée6. Pour une révision approfondie de la technique AFM, lire 7,8,9.
Ce protocole décrit une méthode de préparation d’échantillons de base et une méthode générale pour les mesures d’élasticité basées sur AFM des parois cellulaires végétales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63533/63533fig01v2.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de l’expérience d’indentation de force dans les racines d’Arabidopsis à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Le schéma donne un aperçu des étapes d’une expérience de force-indentation depuis la préparation du substrat pour immobiliser fermement l’échantillon racinaire (1-2), la confirmation de la viabilité de la racine par coloration à l’iodure de propidium (3), le positionnement en porte-à-faux à la surface d’une cellule épidermique allongée de la racine primaire (4-5), la mesure des courbes de force (6) et le traitement de la courbe de force pour calculer le module de Young apparent (7-8). EZ : zone d’allongement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63533/63533fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscopy (AFM)</td>
			<td>BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst Probe holder-fluid</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>CAT-FCH</td>
			<td>A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode.&#160; Also compatible with air operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030</td>
			<td>Gonotech, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td>Duchess Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td>Original concentration, (1962)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical inverted microscope coupled to the AFM</td>
			<td>Olympus IX81, Miami, FL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGAMIL</td>
			<td>ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina</td>
			<td>100429</td>
			<td>Neutral, non acidic silicone glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201.B</td>
			<td>Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For root viability test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>DNP-10/A</td>
			<td>For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-&#956;m-long triangular cantilever,&#160; with a spring constant of 0.35 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4537</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots

Une méthode est décrite ici pour caractériser les propriétés physiques de la paroi cellulaire des cellules épidermiques des racines vivantes d’Arabidopsis par nanoindentations avec un microscope à force atomique (AFM) couplé à un microscope optique à fluorescence inversée. La méthode consiste à appliquer des forces contrôlées à l’échantillon tout en mesurant sa déformation, ce qui permet de quantifier des paramètres tels que le module apparent de Young des parois cellulaires à des résolutions subcellulaires. Cela nécessite une immobilisation mécanique minutieuse de l’échantillon et une sélection correcte des pénétrateurs et des profondeurs d’indentation. Bien qu’elle ne puisse être utilisée que dans les tissus externes, cette méthode permet de caractériser les changements mécaniques dans les parois cellulaires végétales au cours du développement et permet la corrélation de ces changements microscopiques avec la croissance d’un organe entier.

Expériences d’indentation de force Le texte suivant présente certains résultats attendus lorsqu’une expérience d’indentation de force est menée pour montrer la sortie typique à attendre lorsque le protocole est bien exécuté.
Courbes force-déplacement Les diagrammes d’indentation de force représentative qui ont été obtenus en indentant des échantillons vivants à une position placée au centre de la cellule de la zone d’élongation ...

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Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

Le protocole d’indentation par microscopie à force atomique offre la possibilité de disséquer le rôle des propriétés physiques de la paroi cellulaire d’une cellule particulière d’un tissu ou d’un organe pendant une croissance normale ou contrainte (c’est-à-dire sous déficit hydrique).

Microscopie à force atomique pour étudier les propriétés physiques des cellules épidermiques des racines vivantes d’Arabidopsis

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Cette méthode permet de quantifier les changements dans les propriétés physiques de la paroi cellulaire végétale au cours du développement et de relier ces changements microscopiques à la croissance d’un organe entier. Le principal avantage de cette technique est qu’elle n’est pas invasive et qu’elle ne nécessite aucun traitement permettant de quantifier in vivo les propriétés physiques de la paroi cellulaire et d’ajouter une résolution subcellulaire relativement rapide. Pour commencer, étalez une fine couche de colle de silicone dans la boîte de Petri avec un couvercle et laissez-la en l’air pendant 45 secondes.À l’aide d’une pince à épiler, placez le semis sur la colle et orientez sa direction pour éviter tout contact entre les parties saillantes du plant et le porte-à-faux. Appuyez ensuite doucement sur la racine sur la couche de colle de silicone pour la lier fermement. Laissez-le pendant 45 secondes et ajoutez la solution PBS 1X.Montez le porte-à-faux standard en nitrure de silicium avec une pointe pyramidale dans le support de sonde AFM pour fluide, et alignez le laser sur le porte-à-faux près de la position de la pointe. Déplacez ensuite la photodiode pour placer le spot laser au centre du détecteur. Calibrer la sensibilité de déviation en effectuant une indentation avec une taille de rampe de 3 micromètres, un taux d’indentation et de rétraction de 0,6 micromètre par seconde et un seuil de déclenchement de 0,5 volts.Assurez-vous que la sonde n’interagit pas avec l’échantillon et calibrez la constante de ressort du porte-à-faux. À l’aide de l’utilitaire de réglage thermique, cliquez sur calibrer suivi de réglage thermique ou sur l’icône de réglage thermique dans la barre d’outils nanoscope et entrez la température en porte-à-faux. Après avoir sélectionné une gamme de fréquences, cliquez sur le bouton de fluide oscillateur harmonique de l’échantillon.Ensuite, cliquez sur les données acquises dans le panneau de réglage thermique. Maintenant, ajustez la largeur médiane du filtre à trois. Ajustez la largeur du bac PSD pour réduire le bruit dans les données acquises en faisant la moyenne et définissez des limites d’ajustement autour du premier pic de résonance.Cliquez sur calculer la constante de ressort K, puis cliquez sur oui dans la fenêtre contextuelle, en demandant à l’utilisateur si elle souhaite utiliser cette valeur. À l’aide du microscope optique inversé à un grossissement de l’oculaire de 10, 20 et 40 fois, positionner la sonde AFM sur la surface de la quatrième cellule épidermique allongée de la racine primaire en veillant à la positionner au centre de la cellule. Avec la valeur de la constante de ressort précédemment calculée, on obtient des courbes de force avec une taille de rampe de 3 micromètres, un seuil de déclenchement de 11 nanonewtons et un taux d’indentation et de rétraction de 0,6 micromètre par seconde en des points sélectionnés.Obtenir des courbes de force à partir de trois cellules par racine pour chaque traitement et capturer au moins 150 courbes de force pour chaque racine. Ce graphique montre un résultat attendu lorsqu’une expérience d’indentation de force est menée sur des échantillons vivants positionnés au centre de la cellule de la zone d’élongation radiculaire. Lorsque la pointe AFM commence à indenter, la surface de la paroi cellulaire, la force commence à augmenter en raison de l’opposition de la paroi cellulaire à la diffamation.L’augmentation de la force se poursuit jusqu’à ce que la valeur maximale de la force soit atteinte. Après ce point, la partie déchargement de l’indentation commence. La force augmente suivant une parabole dans la partie indentation, ce qui est important pour ajuster chaque courbe au modèle de prédiction pour les pénétrateurs pyramidaux utilisés pour les calculs.En tant que paramètre approprié, la position du point de contact doit correspondre à la surface de la paroi cellulaire avant l’indentation et est considérée comme l’origine du déplacement de la pointe AFM. Courbes de force dans lesquelles il est impossible de détecter le point de contact avant l’indentation doivent être écartées. En outre, la courbe de chargement et de déchargement de l’expérience d’indentation de la force doit être dépourvue de bruit.Après ajustement de chaque courbe de force au modèle, on a obtenu des histogrammes qui ont montré la distribution de la fréquence des valeurs obtenues du module de Young apparent. Cet histogramme montre la fréquence obtenue avec un ensemble de 201 indentations réussies sur neuf cellules différentes de trois plantes différentes de Columbia Zero cultivées dans des conditions de contrôle. L’indentation pourrait être difficile pour certains génotypes en raison de la morphologie de la racine.Par exemple, le double mutant TTL 1 PRC 1-1 s’est développé dans un stress osmotique sévère. Ces histogrammes montrent la distribution de probabilité des valeurs obtenues du module de Young apparent à partir de neuf cellules différentes. Seul l’histogramme H qui correspond à une cellule pourrait être ajusté à une distribution gaussienne.Le métal présenté ici pourrait être combiné avec d’autres techniques telles que des études de vitesse de croissance ou l’analyse de la composition chimique de la paroi cellulaire. Ces autres techniques compléteront davantage les informations pour comprendre comment la composition chimique sur les propriétés physiques de la paroi cellulaire affecte la croissance d’un organe.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imagerie de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nymphe yeux

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Recherche

Biologie du développement

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Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embryons

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

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