Name: atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots
Uploaded: 2022-03-31T13:50:00
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Questa ricerca è stata finanziata da CSIC I + D 2018, sovvenzione n. 95 (Mariana Sotelo Silveira). CSIC Grupos (Omar Borsani) e PEDECIBA.

1. Preparazione del materiale vegetale e condizioni di crescita
<ol><li>Per generare il materiale vegetale necessario, sterilizzare i semi di Arabidopsis wild type e le linee mutanti di interesse. NOTA: In questo protocollo, abbiamo usato quanto segue: ttl1: linee di inserzione del T-DNA Salk_063943 (per TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) wild-type; il mutante Procuste1 (prc1-1), che consiste in una mutazione knock-out (Q720stop) nel gene CESA6 (AT5G64...

<ol>
	<li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+construction,+perception,+and+remodeling+of+plant+cell+walls.">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li><li>Roeder, A. H. 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La meccanica delle cellule e della parete cellulare sta diventando sempre più rilevante per ottenere informazioni su come la meccanica influisce sui processi di crescita. Poiché le forze fisiche si propagano su distanze considerevoli nei tessuti solidi, lo studio dei cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare e di come vengono rilevati, controllati, sintonizzati e influenzano la crescita della pianta stanno diventando un importante campo di studio 2,...

Le cellule vegetali sono circondate da una parete cellulare che è una struttura complessa composta da reti interagenti di polisaccaridi, proteine, metaboliti e acqua che varia in spessore da 0,1 a diversi μm a seconda del tipo di cellula e della fase di crescita 1,2. Le proprietà meccaniche della parete cellulare svolgono un ruolo essenziale nella crescita delle piante. Bassi valori di rigidità della parete cellulare sono stati proposti come precondizione per la crescita cellulare e l'espansione della parete cellulare, e vi è una crescente evidenza che tutte le cellule percepiscono le forze meccaniche per svolgere le loro funzioni. Tuttavia, è ancora dibattuto se i cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare determinino il destino cellulare 2,3,4. Poiché le cellule vegetali non si muovono durante lo sviluppo, la forma finale di un organo dipende da quanto lontano e in quale direzione una cellula si espande. Pertanto, la radice di Arabidopsis è un buon modello per studiare l'impatto delle proprietà fisiche della parete cellulare nell'espansione cellulare perché diversi tipi di espansione si verificano in diverse regioni della radice. Ad esempio, l'espansione anisotropa è evidente nella zona di allungamento e in particolare nelle cellule epidermiche5.
Il metodo qui descritto è stato utilizzato per caratterizzare le proprietà fisiche della parete cellulare delle cellule epidermiche su scala nanometrica delle radici viventi di Arabidopsis utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM) accoppiato con un microscopio a fase di fluorescenza invertita6. Per una revisione approfondita della tecnica AFM, leggere 7,8,9.
Questo protocollo delinea un metodo di preparazione del campione di base e un metodo generale per le misurazioni dell'elasticità basate su AFM delle pareti cellulari delle piante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63533/63533fig01v2.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica dell'esperimento di indentazione della forza nelle radici di Arabidopsis utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Lo schema fornisce una panoramica delle fasi di un esperimento di forza-indentazione dalla preparazione del substrato per immobilizzare saldamente il campione radicale (1-2), conferma della vitalità della radice attraverso colorazione con ioduro di propidio (3), posizionamento a sbalzo sulla superficie di una cellula epidermica allungata della radice primaria (4-5), misurazione delle curve di forza (6) e elaborazione della curva di forza per calcolare il modulo di Young apparente (7-8). EZ: zona di allungamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63533/63533fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscopy (AFM)</td>
			<td>BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst Probe holder-fluid</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>CAT-FCH</td>
			<td>A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode.&#160; Also compatible with air operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030</td>
			<td>Gonotech, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td>Duchess Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td>Original concentration, (1962)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical inverted microscope coupled to the AFM</td>
			<td>Olympus IX81, Miami, FL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGAMIL</td>
			<td>ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina</td>
			<td>100429</td>
			<td>Neutral, non acidic silicone glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201.B</td>
			<td>Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For root viability test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>DNP-10/A</td>
			<td>For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-&#956;m-long triangular cantilever,&#160; with a spring constant of 0.35 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4537</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots

Un metodo è descritto qui per caratterizzare le proprietà fisiche della parete cellulare delle cellule epidermiche delle radici viventi di Arabidopsis attraverso nanoindentazioni con un microscopio a forza atomica (AFM) accoppiato con un microscopio ottico a fluorescenza invertita. Il metodo consiste nell'applicare forze controllate al campione misurandone la deformazione, consentendo di quantificare parametri come l'apparente modulo di Young delle pareti cellulari a risoluzioni subcellulari. Richiede un'attenta immobilizzazione meccanica del campione e una corretta selezione dei penetratori e delle profondità di indentazione. Sebbene possa essere utilizzato solo nei tessuti esterni, questo metodo consente di caratterizzare i cambiamenti meccanici nelle pareti cellulari delle piante durante lo sviluppo e consente la correlazione di questi cambiamenti microscopici con la crescita di un intero organo.

Esperimenti di forza-indentazione Il testo seguente presenta alcuni risultati attesi quando viene condotto un esperimento di indentazione forzata per mostrare l'output tipico da aspettarsi quando il protocollo è ben eseguito.
Curve forza-spostamento I grafici di indentazione della forza rappresentativa ottenuti indentando campioni vivi in una posizione posta al centro della cella della zona di allungamento della radice sono presentati nella <strong clas...

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Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

Il protocollo di indentazione della microscopia a forza atomica offre la possibilità di sezionare il ruolo delle proprietà fisiche della parete cellulare di una particolare cellula di un tessuto o organo durante la crescita normale o limitata (cioè in deficit idrico).

Microscopia a forza atomica per studiare le proprietà fisiche delle cellule epidermiche delle radici vive di Arabidopsis

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Questo metodo consente di quantificare i cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare della pianta durante lo sviluppo e di correlare questi cambiamenti microscopici alla crescita di un intero organo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è invasiva e non richiede alcun trattamento che consenta la quantificazione in vivo delle proprietà fisiche della parete cellulare e la risoluzione subcellulare relativamente rapida. Per iniziare, stendere un sottile strato di colla siliconica nella capsula di Petri con un vetrino di copertura e lasciarlo in aria per 45 secondi.Usando una pinzetta, posiziona la piantina sulla colla e orienta la sua direzione per evitare il contatto tra le parti sporgenti della piantina e il cantilever. Quindi premere delicatamente la radice sullo strato di colla siliconica per legarlo saldamente. Lasciare agire per 45 secondi e aggiungere la soluzione PBS 1X.Montare il cantilever standard in nitruro di silicio con una punta piramidale nel supporto della sonda AFM per il fluido e allineare il laser sul cantilever vicino alla posizione della punta. Quindi spostare il fotodiodo per posizionare il punto laser al centro del rilevatore. Calibrare la sensibilità di deflessione eseguendo una rientranza con una dimensione della rampa di 3 micrometri, una velocità di rientro e retrazione di 0,6 micrometri al secondo e una soglia di attivazione di 0,5 volt.Assicurarsi che la sonda non interagisca con il campione e calibrare la costante della molla del cantilever . Utilizzando l'utilità di regolazione termica, fare clic su calibra seguito da sintonizzazione termica o sull'icona di regolazione termica nella barra degli strumenti del nano scope e immettere la temperatura a sbalzo. Dopo aver selezionato una gamma di frequenze, fare clic sul pulsante del fluido oscillatore armonico campione.Quindi, fai clic sui dati acquisiti nel pannello di sintonizzazione termica. Ora, regola la larghezza mediana del filtro a tre. Regola la larghezza di binaggio PSD per ridurre il rumore nei dati acquisiti calcolando la media e imposta i limiti di adattamento intorno al primo picco di risonanza.Fare clic su calcola costante di molla K, quindi fare clic su sì nella finestra pop-up, chiedendo se l'utente desidera utilizzare questo valore. Utilizzando il microscopio ottico invertito a 10, 20 e 40 volte l'ingrandimento dell'oculare, posizionare la sonda AFM sulla superficie della quarta cellula epidermica allungata della radice primaria assicurandosi di posizionarla al centro della cellula. Con il valore della costante della molla precedentemente calcolato si sono ottenute curve di forza con una dimensione della rampa di 3 micrometri, una soglia di innesco di 11 nanonewton e una velocità di indentazione e retrazione di 0,6 micrometri al secondo in punti selezionati.Ottenere curve di forza da tre celle per radice per ogni trattamento e catturare almeno 150 curve di forza per ogni radice. Questo grafico mostra un risultato atteso quando un esperimento di indentazione della forza viene condotto su campioni vivi posizionati al centro della cella della zona di allungamento della radice. Quando la punta AFM inizia a rientrare, la superficie della parete cellulare, la forza inizia ad aumentare a causa dell'opposizione della parete cellulare alla diffamazione.L'aumento della forza continua fino al raggiungimento del valore massimo della forza. Dopo questo punto, inizia la parte di scarico dell'indentazione. La forza cresce seguendo una parabola nella parte di indentazione, che è importante per adattare ogni curva al modello di previsione per i penetratori piramidali utilizzati per i calcoli.Come parametro di adattamento, la posizione del punto di contatto deve corrispondere alla superficie della parete cellulare prima dell'indentazione ed è considerata l'origine dello spostamento della punta AFM. Curve di forza in cui è impossibile rilevare il punto di contatto prima che l'indentazione venga scartata. Inoltre, la curva di carico e scarico dell'esperimento di indentazione della forza deve essere priva di rumore.Dopo aver adattato ogni curva di forza al modello, sono stati ottenuti istogrammi che mostravano la distribuzione della frequenza dei valori ottenuti del modulo di Young apparente. Questo istogramma mostra la frequenza ottenuta con una serie di 201 rientranze riuscite su nove diverse cellule di tre diverse piante di Columbia Zero coltivate in condizioni di controllo. L'indentazione potrebbe essere difficile per alcuni genotipi a causa della morfologia della radice.Ad esempio, il doppio mutante TTL 1 PRC 1-1 cresciuto in grave stress osmotico. Questi istogrammi mostrano la distribuzione di probabilità dei valori ottenuti del modulo di Young apparente da nove celle diverse. Solo l'istogramma H che corrisponde a una cella potrebbe essere adattato a una distribuzione gaussiana.Il metallo qui presentato potrebbe essere combinato con altre tecniche come studi sul tasso di crescita o analisi della composizione chimica della parete cellulare. Queste altre tecniche completeranno ulteriormente le informazioni per capire come la composizione chimica sulle proprietà fisiche della parete cellulare influenzi la crescita di un organo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

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Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

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