Name: atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots
Uploaded: 2022-03-31T13:50:00
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이 연구는 CSIC I + D 2018, 보조금 번호 95 (Mariana Sotelo Silveira)의 자금 지원을 받았습니다.; CSIC 그루포스 (오마르 보르사니) 와 페데시바.

1. 식물 재료의 준비 및 성장 조건
<ol><li>필요한 식물 재료를 생성하려면 Arabidopsis 야생형과 돌연변이 관심 라인의 씨앗을 살균하십시오. 참고: 이 프로토콜에서는 다음을 사용했습니다: ttl1: T-DNA 삽입 라인 Salk_063943(TTL1의 경우; AT1G53300) - 콜롬비아-0(Col-0) 야생형; 앞서 10,11에 기술된 바와 같이 CESA6 유전자(AT5G64740)의 녹아웃 돌연변이(Q720stop)로 구성...

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+instrument+to+standardise+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).</li><li>Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+elastic+modulus+and+hysteresis+of+skeletal+muscle+cells+throughout+differentiation.">Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).</li><li>Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+cardiac+muscle+and+skeletal+muscle+exhibit+different+viscous+and+elastic+properties+as+determined+by+atomic+force+microscopy.">Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).</li><li>Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+elasticity+and+adhesion+of+live+cells+by+atomic+force+microscopy+indentation.">Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation.</a> European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+At+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Fernandes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+epidermal+cells+of+whole+living+roots+of+Arabidopsis+thaliana:+An+atomic+force+microscopy+study.">Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study.</a> Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).</li></ol>

세포 및 세포벽 역학은 역학이 성장 과정에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻기 위해 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다. 물리적 힘이 고형 조직에서 상당한 거리에 걸쳐 전파됨에 따라 세포벽의 물리적 특성 변화와 이러한 특성이 식물의 성장을 감지, 제어, 조정 및 영향을 미치는 방법에 대한 연구가 중요한 연구 분야가 되고 있습니다 2,3,8.<sup class="x...

식물 세포는 세포 유형과 성장 단계에 따라 두께가 0.1에서 수 μm까지 다양한 다당류, 단백질, 대사 산물 및 물의 상호 작용 네트워크로 구성된 복잡한 구조 인 세포벽으로 둘러싸여 있습니다 1,2. 세포벽의 기계적 특성은 식물의 성장에 필수적인 역할을 합니다. 세포벽의 낮은 강성 값은 세포 성장 및 세포벽 확장의 전제 조건으로 제안되었으며 모든 세포가 기능을 수행하기 위해 기계적 힘을 감지한다는 증거가 증가하고 있습니다. 그러나 세포벽의 물리적 특성의 변화가 세포 운명 2,3,4를 결정하는지 여부는 여전히 논쟁의 여지가 있습니다. 식물 세포는 발달 중에 움직이지 않기 때문에 장기의 최종 모양은 세포가 얼마나 멀리 그리고 어떤 방향으로 확장되는지에 달려 있습니다. 따라서, 애기장대 뿌리는 뿌리의 다른 영역에서 다른 유형의 확장이 발생하기 때문에 세포 확장에서 세포벽 물리적 특성의 영향을 연구하기에 좋은 모델입니다. 예를 들어, 이방성 확장은 신장 영역에서 그리고 특히 표피 세포에서 두드러지게 나타난다5.
여기에 설명 된 방법은 도립 형광 위상 현미경 6과 결합 된 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 살아있는 애기장대 뿌리의 나노 스케일에서 표피 세포의 세포벽의 물리적 특성을 특성화하는 데사용되었습니다. AFM 기술의 광범위한 개정판은 7,8,9를 참조하십시오.
이 프로토콜은 식물 세포벽의 AFM 기반 탄성 측정을 위한 기본 샘플 준비 방법과 일반적인 방법을 간략하게 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63533/63533fig01v2.jpg"> 그림 1: 원자력 현미경(AFM)을 사용한 애기장대 뿌리의 힘 압입 실험의 개략적인 개요. 이 계획은 뿌리 샘플을 단단히 고정하기 위한 기질 준비(1-2), 요오드화 프로피듐 염색을 통한 뿌리 생존력 확인(3), 1차 뿌리의 길쭉한 표피 세포 표면에 캔틸레버 위치(4-5), 힘 곡선 측정(6) 및 겉보기 영률을 계산하기 위한 힘 곡선 처리(7-8). EZ: 신장 영역. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63533/63533fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscopy (AFM)</td>
			<td>BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst Probe holder-fluid</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>CAT-FCH</td>
			<td>A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode.&#160; Also compatible with air operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030</td>
			<td>Gonotech, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td>Duchess Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td>Original concentration, (1962)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical inverted microscope coupled to the AFM</td>
			<td>Olympus IX81, Miami, FL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGAMIL</td>
			<td>ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina</td>
			<td>100429</td>
			<td>Neutral, non acidic silicone glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201.B</td>
			<td>Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For root viability test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>DNP-10/A</td>
			<td>For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-&#956;m-long triangular cantilever,&#160; with a spring constant of 0.35 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4537</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots

광학 도립 형광 현미경과 결합 된 원자력 현미경 (AFM)으로 나노 압입을 통해 살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포 세포벽의 물리적 특성을 특성화하는 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 변형을 측정하는 동안 샘플에 제어된 힘을 가하는 것으로 구성되어 세포 내 분해능에서 세포벽의 겉보기 영률과 같은 파라미터를 정량화할 수 있습니다. 샘플의 신중한 기계적 고정과 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 외부 조직에서만 사용할 수 있지만이 방법을 사용하면 발달 중 식물 세포벽의 기계적 변화를 특성화 할 수 있으며 이러한 미세한 변화와 전체 장기의 성장의 상관 관계를 가능하게합니다.

힘-압입 실험 다음 텍스트는 프로토콜이 잘 실행될 때 예상되는 일반적인 출력을 보여주기 위해 강제 들여쓰기 실험을 수행할 때 예상되는 몇 가지 결과를 제공합니다.
힘-변위 곡선 루트 신장 영역의 셀 중앙에 배치된 위치에서 살아있는 샘플을 들여쓰기하여 얻은 대표적인 힘 압입 플롯이 그림 2에 나와 있습니다. AFM 팁이...

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Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

원자력 현미경 압입 프로토콜은 정상 또는 제한된 성장 (즉, 물 부족 상태) 동안 조직 또는 기관의 특정 세포의 세포벽의 물리적 특성의 역할을 해부 할 수있는 가능성을 제공합니다.

살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

이 방법을 사용하면 발달 중 식물 세포벽의 물리적 특성 변화를 정량화하고이 미세한 변화를 전체 장기의 성장과 관련시킬 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 침습적이지 않으며 세포벽의 물리적 특성의 생체 내 정량화가 세포 내 분해능을 비교적 빠르게 추가 할 수있는 치료가 필요하지 않다는 것입니다. 시작하려면 커버 슬립으로 페트리 접시에 실리콘 접착제의 얇은 층을 펴고 45 초 동안 공기 중에 두십시오.핀셋을 사용하여 묘목을 접착제 위에 놓고 묘목의 튀어 나온 부분과 캔틸레버 사이의 접촉을 피하기 위해 방향을 향하게하십시오. 그런 다음 뿌리를 실리콘 접착제 층에 부드럽게 눌러 단단히 묶습니다. 45초 동안 그대로 두고 1X PBS 솔루션을 추가합니다.피라미드 팁이 있는 표준 실리콘 질화물 캔틸레버를 유체용 AFM 프로브 홀더에 장착하고 캔틸레버의 레이저를 팁 위치에 가깝게 정렬합니다. 그런 다음 포토 다이오드를 움직여 레이저 스폿을 검출기 중앙에 배치합니다. 램프 크기가 3마이크로미터, 압입 및 수축률이 초당 0.6마이크로미터, 트리거 임계값이 0.5V인 압입 감도를 수행하여 편향 감도를 보정합니다.프로브가 샘플과 상호 작용하지 않는지 확인하고 캔틸레버의 스프링 상수를 보정합니다. 열 조정 유틸리티를 사용하여 보정을 클릭한 다음 열 조정을 클릭하거나 나노 스코프 도구 모음의 열 조정 아이콘을 클릭하고 캔틸레버 온도를 입력합니다. 주파수 범위를 선택한 후 샘플 고조파 발진기 유체 버튼을 클릭합니다.그런 다음 열 조정 패널에서 수집된 데이터를 클릭합니다. 이제 중앙값 필터 너비를 3으로 조정합니다. PSD binwidth를 조정하여 평균화하여 수집된 데이터의 노이즈를 줄이고 첫 번째 공진 피크 주변의 피팅 경계를 설정합니다.스프링 상수 K 계산을 클릭 한 다음 팝업 창에서 예를 클릭하여 사용자가이 값을 사용할 것인지 묻습니다. 10, 20 및 40 배 접안 렌즈 배율의 도립 광학 현미경을 사용하여 AFM 프로브를 1 차 뿌리의 네 번째 길쭉한 표피 세포 표면에 배치하여 세포 중앙에 위치시킵니다. 이전에 계산 된 스프링 상수 값으로 3 마이크로 미터의 램프 크기, 11 나노 뉴턴의 트리거 임계 값, 선택한 지점에서 초당 0.6 마이크로 미터의 압입 및 수축 속도를 갖는 힘 곡선을 얻었습니다.각 처리에 대해 루트당 3개의 셀에서 힘 곡선을 얻고 각 루트에 대해 최소 150개의 힘 곡선을 캡처합니다. 이 그림은 루트 신장 영역의 셀 중심에 위치한 라이브 샘플에 대해 힘 압입 실험을 수행할 때 예상되는 결과를 보여줍니다. AFM 팁이 들여쓰기를 시작하면, 세포벽의 표면이 명예훼손에 반대하기 때문에 힘이 증가하기 시작한다.힘의 증가는 최대 힘 값에 도달할 때까지 계속됩니다. 이 시점이 지나면 들여 쓰기의 언로드 부분이 시작됩니다. 압입 부분의 포물선을 따라 힘이 증가하며, 이는 계산에 사용되는 피라미드 압자에 대한 예측 모델에 각 곡선을 맞추는 데 중요합니다.피팅 매개 변수로서 접촉점 위치는 압입 전의 셀 벽 표면과 일치해야하며 AFM 팁 변위의 원점으로 간주됩니다. 압입 전에 접촉점을 감지 할 수없는 힘 곡선은 버려야합니다. 또한, 힘 압입 실험의 로딩 및 언로딩 곡선에는 노이즈가 없어야 합니다.각 힘 곡선을 모델에 맞춘 후, 겉보기 영률의 얻어진 값의 빈도 분포를 보여주는 히스토그램을 얻었다. 이 히스토그램은 대조 조건에서 성장한 Columbia Zero의 3 개의 서로 다른 식물의 9 개의 다른 세포에 대해 201 개의 성공적인 들여 쓰기 세트로 얻은 빈도를 보여줍니다. 들여쓰기는 뿌리의 형태로 인해 일부 유전자형의 경우 어려울 수 있습니다.예를 들어, TTL 1PRC 1-1 이중 돌연변이체는 심각한 삼투압 스트레스에서 성장하였다. 이 히스토그램은 9 개의 서로 다른 세포에서 얻은 겉보기 영률 값의 확률 분포를 보여줍니다. 하나의 셀에 해당하는 히스토그램 H만 가우스 분포에 맞출 수 있습니다.여기에 제시된 금속은 성장 속도 연구 또는 세포벽의 화학적 조성 분석과 같은 다른 기술과 결합 될 수 있습니다. 이러한 다른 기술은 세포벽의 물리적 특성에 대한 화학적 조성이 장기의 성장에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위해 정보를 더욱 보완합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

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의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

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Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

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