Name: atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots
Uploaded: 2022-03-31T13:50:00
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Esta investigação foi financiada pelo CSIC I+D 2018, bolsa n.º 95 (Mariana Sotelo Silveira).; CSIC Grupos (Omar Borsani) e PEDECIBA.

1. Preparação do material vegetal e condições de crescimento
<ol><li>Para gerar o material vegetal necessário, esterilize as sementes do tipo selvagem Arabidopsis e linhas mutantes de interesse. NOTA: Neste protocolo, utilizou-se o seguinte: ttl1: linhas de inserção de T-DNA Salk_063943 (para TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) tipo selvagem; o mutante Procuste1 (prc1-1), que consiste em uma mutação knock-out (Q720stop) no gene CESA6 (AT5G64740...

<ol>
	<li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+construction,+perception,+and+remodeling+of+plant+cell+walls.">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li><li>Roeder, A. H. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arabidopsis+tetratricopeptide+thioredoxin-like+1+gene+is+involved+in+anisotropic+root+growth+during+osmotic+stress+adaptation.">The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation.</a> Genes. 12 (2), 236 (2021).</li><li>Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinking+the+hammer:+micromechanical+approaches+to+morphogenesis.">Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).</li><li>Braybrook, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+instrument+to+standardise+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).</li><li>Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+elastic+modulus+and+hysteresis+of+skeletal+muscle+cells+throughout+differentiation.">Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).</li><li>Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+cardiac+muscle+and+skeletal+muscle+exhibit+different+viscous+and+elastic+properties+as+determined+by+atomic+force+microscopy.">Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).</li><li>Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+elasticity+and+adhesion+of+live+cells+by+atomic+force+microscopy+indentation.">Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation.</a> European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+At+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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A mecânica celular e da parede celular está se tornando cada vez mais relevante para obter informações sobre como a mecânica afeta os processos de crescimento. À medida que as forças físicas se propagam por distâncias consideráveis nos tecidos sólidos, o estudo das mudanças nas propriedades físicas da parede celular e como elas são sentidas, controladas, ajustadas e impactam o crescimento da planta estão se tornando um importante campo de estudo 2,3,8</s...

As células vegetais são circundadas por uma parede celular que é uma estrutura complexa composta por redes interativas de polissacarídeos, proteínas, metabólitos e água que varia em espessura de 0,1 a vários μm, dependendo do tipo celular e da fase de crescimento 1,2. As propriedades mecânicas da parede celular desempenham um papel essencial no crescimento das plantas. Baixos valores de rigidez da parede celular têm sido propostos como uma pré-condição para o crescimento celular e a expansão da parede celular, e há evidências crescentes de que todas as células sentem forças mecânicas para desempenhar suas funções. No entanto, ainda é debatido se as alterações nas propriedades físicas da parede celular determinam o destino celular 2,3,4. Como as células vegetais não se movem durante o desenvolvimento, a forma final de um órgão depende de quão longe e em que direção uma célula se expande. Assim, a raiz de Arabidopsis é um bom modelo para estudar o impacto das propriedades físicas da parede celular na expansão celular, pois diferentes tipos de expansão ocorrem em diferentes regiões da raiz. Por exemplo, a expansão anisotrópica é evidente na zona de alongamento e, particularmente, nas células epidérmicas5.
O método aqui descrito foi utilizado para caracterizar as propriedades físicas da parede celular de células epidérmicas em nanoescala de raízes vivas de Arabidopsis utilizando um Microscópio de Força Atômica (AFM) acoplado a um microscópio de fase de fluorescência invertida6. Para uma extensa revisão da técnica AFM, leia 7,8,9.
Este protocolo descreve um método básico de preparação de amostras e um método geral para medições de elasticidade baseadas em AFM de paredes celulares de plantas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63533/63533fig01v2.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática do experimento de indentação de força em raízes de Arabidopsis usando microscopia de força atômica (AFM). O esquema fornece uma visão geral das etapas de um experimento de Força-Indentação desde a preparação do substrato para imobilizar a amostra radicular firmemente (1-2), confirmação da viabilidade radicular através da coloração de iodeto de propídio (3), posicionamento do cantilever na superfície de uma célula epidérmica alongada da raiz primária (4-5), medição de curvas de força (6) e processamento de curva de força para calcular o módulo aparente de Young (7-8). EZ: zona de alongamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63533/63533fig01largev2.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscopy (AFM)</td>
			<td>BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst Probe holder-fluid</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>CAT-FCH</td>
			<td>A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode.&#160; Also compatible with air operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030</td>
			<td>Gonotech, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td>Duchess Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td>Original concentration, (1962)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical inverted microscope coupled to the AFM</td>
			<td>Olympus IX81, Miami, FL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGAMIL</td>
			<td>ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina</td>
			<td>100429</td>
			<td>Neutral, non acidic silicone glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201.B</td>
			<td>Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For root viability test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>DNP-10/A</td>
			<td>For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-&#956;m-long triangular cantilever,&#160; with a spring constant of 0.35 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4537</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots

Um método é descrito aqui para caracterizar as propriedades físicas da parede celular de células epidérmicas de raízes vivas de Arabidopsis através de nanoindentações com um microscópio de força atômica (AFM) acoplado a um microscópio óptico de fluorescência invertida. O método consiste em aplicar forças controladas à amostra enquanto mede sua deformação, permitindo quantificar parâmetros como o módulo aparente de Young das paredes celulares em resoluções subcelulares. Requer uma cuidadosa imobilização mecânica da amostra e seleção correta de indenters e profundidades de recuo. Embora possa ser usado apenas em tecidos externos, este método permite caracterizar mudanças mecânicas nas paredes celulares das plantas durante o desenvolvimento e permite a correlação dessas alterações microscópicas com o crescimento de um órgão inteiro.

Experimentos de Força-Indentação O texto a seguir apresenta alguns resultados esperados quando um experimento de recuo de força é conduzido para mostrar a saída típica a ser esperada quando o protocolo é bem executado.
Curvas de deslocamento de força As parcelas representativas de recuo de força que foram obtidas recuando amostras vivas em uma posição colocada no centro da célula da zona de alongamento radicular são apresentadas na <strong ...

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Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

O protocolo de indentação por microscopia de força atômica oferece a possibilidade de dissecar o papel das propriedades físicas da parede celular de uma determinada célula de um tecido ou órgão durante o crescimento normal ou restrito (ou seja, sob déficit hídrico).

Microscopia de Força Atômica para Estudo das Propriedades Físicas de Células Epidérmicas de Raízes Vivas de Arabidopsis

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Este método permite quantificar as mudanças nas propriedades físicas da parede celular da planta durante o desenvolvimento e relacionar essas mudanças microscópicas com o crescimento de um órgão inteiro. A principal vantagem desta técnica é que não é invasiva e não requer nenhum tratamento que permita a quantificação in vivo das propriedades físicas da parede celular adicionar resolução subcelular relativamente rápida. Para começar, espalhe uma fina camada de cola de silicone na placa de Petri com uma tampa deslizante e deixe-a no ar por 45 segundos.Usando uma pinça, coloque a muda na cola e oriente sua direção para evitar o contato entre as partes salientes da muda e o balanço. Em seguida, pressione a raiz suavemente na camada de cola de silicone para ligá-la firmemente. Deixe-o por 45 segundos e adicione a solução PBS 1X.Monte o cantilever de nitreto de silício padrão com uma ponta piramidal no suporte da sonda AFM para fluido e alinhe o laser no cantilever perto da posição da ponta. Em seguida, mova o diodo da foto para colocar o ponto de laser no centro do detector. Calibre a sensibilidade de deflexão realizando um recuo com um tamanho de rampa de 3 micrômetros, uma taxa de recuo e retração de 0,6 micrômetros por segundo e um limiar de gatilho de 0,5 volts.Certifique-se de que a sonda não está interagindo com a amostra e calibre a constante de mola do balanço. Usando o utilitário de sintonia térmica, clique em calibrar seguido de sintonia térmica ou no ícone de sintonia térmica na barra de ferramentas do nano scope e insira a temperatura do cantilever. Depois de selecionar uma faixa de frequência, clique no botão de fluido oscilador harmônico da amostra.Em seguida, clique nos dados adquiridos no painel de sintonia térmica. Agora, ajuste a largura média do filtro para três. Ajuste a largura do compartimento PSD para reduzir o ruído nos dados adquiridos, calculando a média e defina limites de ajuste em torno do primeiro pico de ressonância.Clique em calcular a constante de mola K e, em seguida, clique em sim na janela pop-up, perguntando se o usuário deseja usar esse valor. Usando o microscópio óptico invertido em 10, 20 e 40 vezes a ampliação da ocular, posicione a sonda AFM na superfície da quarta célula epidérmica alongada da raiz primária, certificando-a de posicioná-la no centro da célula. Com o valor constante de mola previamente calculado obteve curvas de força com um tamanho de rampa de 3 micrômetros, um limiar de gatilho de 11 nanonewton e uma taxa de recuo e retração de 0,6 micrômetros por segundo em pontos selecionados.Obter curvas de força de três células por raiz para cada tratamento e capturar pelo menos 150 curvas de força para cada raiz. Este gráfico mostra um resultado esperado quando um experimento de recuo de força é conduzido em amostras vivas posicionadas no centro da célula da zona de alongamento radicular. Quando a ponta do AFM começa a recuar, a superfície da parede celular, a força começa a aumentar por causa da oposição da parede celular à difamação.O aumento da força continua até que o valor máximo da força seja atingido. Após esse ponto, a parte de descarga do recuo começa. A força cresce após uma parábola na parte de recuo, que é importante para ajustar cada curva ao modelo de previsão para indenters piramidais usado para cálculos.Como parâmetro de ajuste, a posição do ponto de contato deve corresponder à superfície da parede celular antes do recuo e é considerada a origem do deslocamento da ponta AFM. Curvas de força nas quais é impossível detectar o ponto de contato antes que o recuo seja descartado. Além disso, a curva de carga e descarga do experimento de indentação de força deve ser desprovida de ruído.Após o ajuste de cada curva de força ao modelo, foram obtidos histogramas que mostraram a distribuição da frequência dos valores obtidos do módulo de Young aparente. Este histograma mostra a frequência obtida com um conjunto de 201 reentrâncias bem-sucedidas em nove células diferentes de três plantas diferentes de Columbia Zero cultivadas em condições de controle. A indentação pode ser difícil para alguns genótipos devido à morfologia da raiz.Por exemplo, o duplo mutante TTL 1 PRC 1-1 cresceu em estresse osmótico grave. Estes histogramas mostram a distribuição de probabilidade dos valores obtidos do módulo de Young aparente a partir de nove células diferentes. Somente o histograma H que corresponde a uma célula poderia ser ajustado a uma distribuição gaussiana.O metal aqui apresentado poderia ser combinado com outras técnicas, como estudos de taxa de crescimento ou análise da composição química da parede celular. Essas outras técnicas complementarão ainda mais as informações para entender como a composição química nas propriedades físicas da parede celular afeta o crescimento de um órgão.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

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Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

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The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

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In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

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Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

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In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

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