Name: atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots
Uploaded: 2022-03-31T13:50:00
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Esta investigación ha sido financiada por el CSIC I+D 2018, beca nº 95 (Mariana Sotelo Silveira); CSIC Grupos (Omar Borsani) y PEDECIBA.

1. Preparación del material vegetal y condiciones de crecimiento
<ol><li>Para generar el material vegetal necesario, esterilice las semillas de tipo salvaje Arabidopsis y líneas mutantes de interés. NOTA: En este protocolo, utilizamos lo siguiente: ttl1: líneas de inserción de ADN-T Salk_063943 (para TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) tipo salvaje; el mutante Procuste1 (prc1-1), que consiste en una mutación knock-out (Q720stop) en el gen CESA6 (A...

<ol>
	<li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+construction,+perception,+and+remodeling+of+plant+cell+walls.">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li><li>Roeder, A. H. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arabidopsis+tetratricopeptide+thioredoxin-like+1+gene+is+involved+in+anisotropic+root+growth+during+osmotic+stress+adaptation.">The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation.</a> Genes. 12 (2), 236 (2021).</li><li>Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinking+the+hammer:+micromechanical+approaches+to+morphogenesis.">Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).</li><li>Braybrook, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+instrument+to+standardise+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).</li><li>Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+elastic+modulus+and+hysteresis+of+skeletal+muscle+cells+throughout+differentiation.">Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).</li><li>Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. 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La mecánica celular y de pared celular se está volviendo cada vez más relevante para obtener información sobre cómo la mecánica afecta los procesos de crecimiento. A medida que las fuerzas físicas se propagan a distancias considerables en los tejidos sólidos, el estudio de los cambios en las propiedades físicas de la pared celular y cómo se detectan, controlan, sintonizan e impactan el crecimiento de la planta se están convirtiendo en un importante campo de estudio </s...

Las células vegetales están rodeadas por una pared celular que es una estructura compleja compuesta de redes interactivas de polisacáridos, proteínas, metabolitos y agua que varía en grosor de 0,1 a varios μm dependiendo del tipo de célula y la fase de crecimiento 1,2. Las propiedades mecánicas de la pared celular juegan un papel esencial en el crecimiento de las plantas. Los bajos valores de rigidez de la pared celular se han propuesto como una condición previa para el crecimiento celular y la expansión de la pared celular, y cada vez hay más pruebas de que todas las células detectan fuerzas mecánicas para realizar sus funciones. Sin embargo, todavía se debate si los cambios en las propiedades físicas de la pared celular determinan el destino celular 2,3,4. Debido a que las células vegetales no se mueven durante el desarrollo, la forma final de un órgano depende de qué tan lejos y en qué dirección se expande una célula. Por lo tanto, la raíz de Arabidopsis es un buen modelo para estudiar el impacto de las propiedades físicas de la pared celular en la expansión celular porque se producen diferentes tipos de expansión en diferentes regiones de la raíz. Por ejemplo, la expansión anisotrópica es evidente en la zona de elongación y particularmente notable en las células epidérmicas5.
El método descrito aquí se utilizó para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas a nanoescala de raíces vivas de Arabidopsis utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio de fase de fluorescencia invertida6. Para una revisión extensa de la técnica AFM, lea 7,8,9.
Este protocolo describe un método básico de preparación de muestras y un método general para mediciones de elasticidad basadas en AFM de paredes celulares vegetales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63533/63533fig01v2.jpg"> Figura 1: Resumen esquemático del experimento de indentación de fuerza en raíces de Arabidopsis utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El esquema ofrece una visión general de los pasos de un experimento de Fuerza-Indentación desde la preparación del sustrato para inmovilizar firmemente la muestra de raíz (1-2), la confirmación de la viabilidad de la raíz a través de la tinción de yoduro de propidio (3), el posicionamiento en voladizo en la superficie de una célula epidérmica alargada de la raíz primaria (4-5), la medición de curvas de fuerza (6) y el procesamiento de la curva de fuerza para calcular el módulo de Young aparente (7-8). EZ: zona de elongación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63533/63533fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscopy (AFM)</td>
			<td>BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalyst Probe holder-fluid</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>CAT-FCH</td>
			<td>A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode.&#160; Also compatible with air operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030</td>
			<td>Gonotech, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td>Duchess Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td>Original concentration, (1962)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical inverted microscope coupled to the AFM</td>
			<td>Olympus IX81, Miami, FL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGAMIL</td>
			<td>ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina</td>
			<td>100429</td>
			<td>Neutral, non acidic silicone glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201.B</td>
			<td>Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For root viability test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A</td>
			<td>Bruker, Billerica, MA, USA</td>
			<td>DNP-10/A</td>
			<td>For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-&#956;m-long triangular cantilever,&#160; with a spring constant of 0.35 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4537</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy to study the physical properties of epidermal cells of live arabidopsis roots

Aquí se describe un método para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis a través de nanoindentaciones con un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio óptico de fluorescencia invertida. El método consiste en aplicar fuerzas controladas a la muestra mientras se mide su deformación, permitiendo cuantificar parámetros como el aparente módulo de Young de las paredes celulares a resoluciones subcelulares. Requiere una cuidadosa inmovilización mecánica de la muestra y una correcta selección de penetradores y profundidades de hendidura. Aunque solo se puede usar en tejidos externos, este método permite caracterizar los cambios mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo y permite la correlación de estos cambios microscópicos con el crecimiento de un órgano completo.

Experimentos de forzamiento-sangría El siguiente texto presenta algunos resultados esperados cuando se realiza un experimento de sangría forzada para mostrar la salida típica que se espera cuando el protocolo está bien ejecutado.
Curvas fuerza-desplazamiento En la Figura 2 se presentan gráficas representativas de indentación de fuerza que se obtuvieron sangrando de muestras vivas en una posición colocada en el centro ...

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Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

El protocolo de indentación de microscopía de fuerza atómica ofrece la posibilidad de diseccionar el papel de las propiedades físicas de la pared celular de una célula particular de un tejido u órgano durante el crecimiento normal o restringido (es decir, bajo déficit de agua).

Microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Este método permite cuantificar los cambios en las propiedades físicas de la pared celular de la planta durante el desarrollo y relacionar estos cambios microscópicos con el crecimiento de todo un órgano. La principal ventaja de esta técnica es que no es invasiva y no requiere ningún tratamiento que permita la cuantificación in vivo de las propiedades físicas de la pared celular añadiendo resolución subcelular relativamente rápida. Para comenzar, extienda una capa delgada de pegamento de silicona en la placa de Petri con un cubreobjetos y déjelo en el aire durante 45 segundos.Usando pinzas, coloque la plántula sobre el pegamento y oriente su dirección para evitar el contacto entre las partes sobresalientes de la plántula y el voladizo. Luego presione la raíz suavemente contra la capa de pegamento de silicona para unirla firmemente. Déjelo durante 45 segundos y agregue la solución 1X PBS.Monte el voladizo de nitruro de silicio estándar con una punta piramidal en el soporte de la sonda AFM para fluido, y alinee el láser en el voladizo cerca de la posición de la punta. Luego mueva el fotodiodo para colocar el punto láser en el centro del detector. Calibre la sensibilidad a la deflexión realizando una hendidura con un tamaño de rampa de 3 micrómetros, una velocidad de indentación y retracción de 0,6 micrómetros por segundo y un umbral de disparo de 0,5 voltios.Asegúrese de que la sonda no interactúe con la muestra y calibre la constante de resorte del voladizo. Con la utilidad de ajuste térmico, haga clic en calibrar seguido de ajuste térmico o en el icono de ajuste térmico en la barra de herramientas del nanoscopio e ingrese la temperatura en voladizo. Después de seleccionar un rango de frecuencia, haga clic en el botón del fluido oscilador armónico de muestra.A continuación, haga clic en los datos adquiridos en el panel de ajuste térmico. Ahora, ajuste el ancho medio del filtro a tres. Ajuste el ancho de binwidth de PSD para reducir el ruido en los datos adquiridos promediando y estableciendo límites de ajuste alrededor del primer pico de resonancia.Haga clic en calcular la constante de resorte K y luego haga clic en sí en la ventana emergente, preguntando si el usuario desea usar este valor. Usando el microscopio óptico invertido a 10, 20 y 40 veces el aumento del ocular, coloque la sonda AFM en la superficie de la cuarta célula epidérmica alargada de la raíz primaria asegurándose de colocarla en el centro de la célula. Con el valor constante de resorte calculado previamente se obtuvieron curvas de fuerza con un tamaño de rampa de 3 micrómetros, un umbral de activación de 11 nanonewton, y una tasa de indentación y retracción de 0,6 micrómetros por segundo en puntos seleccionados.Obtenga curvas de fuerza de tres células por raíz para cada tratamiento y capture al menos 150 curvas de fuerza para cada raíz. Este gráfico muestra un resultado esperado cuando se realiza un experimento de indentación de fuerza en muestras vivas colocadas en el centro de la celda de la zona de elongación de la raíz. Cuando la punta AFM comienza a sangrar la superficie de la pared celular, la fuerza comienza a aumentar debido a la oposición de la pared celular a la difamación.El aumento de la fuerza continúa hasta que se alcanza el valor máximo de fuerza. Después de este punto, comienza la parte de descarga de la sangría. La fuerza crece después de una parábola en la parte de indentación, que es importante para ajustar cada curva al modelo de predicción para penetradores piramidales utilizados para los cálculos.Como parámetro de ajuste, la posición del punto de contacto debe corresponder a la superficie de la pared celular antes de la hendidura y se considera el origen del desplazamiento de la punta AFM. Las curvas de fuerza en las que es imposible detectar el punto de contacto antes de la hendidura deben descartarse. Además, la curva de carga y descarga del experimento de indentación de fuerza debe estar desprovista de ruido.Después de ajustar cada curva de fuerza al modelo, se obtuvieron histogramas que mostraron la distribución de la frecuencia de los valores obtenidos del módulo de Young aparente. Este histograma muestra la frecuencia obtenida con un conjunto de 201 hendiduras exitosas en nueve celdas diferentes de tres plantas diferentes de Columbia Zero cultivadas en condiciones de control. La hendidura podría ser difícil para algunos genotipos debido a la morfología de la raíz.Por ejemplo, el mutante doble TTL 1 PRC 1-1 creció en estrés osmótico severo. Estos histogramas muestran la distribución de probabilidad de los valores obtenidos del módulo de Young aparente a partir de nueve celdas diferentes. Sólo el histograma H que corresponde a una celda podría ajustarse a una distribución gaussiana.El metal aquí presentado podría combinarse con otras técnicas como estudios de tasa de crecimiento o análisis de la composición química de la pared celular. Estas otras técnicas complementarán aún más la información para comprender cómo la composición química en las propiedades físicas de la pared celular afecta el crecimiento de un órgano.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

El aislamiento de células madre del folículo piloso y queratinocitos epidérmicos de la piel dorsal de ratón

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

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Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

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In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...