Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر هاينر على قراءتهم وتعليقاتهم على نسخة سابقة من هذه المخطوطة. استخدم هذا المشروع NextSeq500 المتوفر في مركز تسلسل العلوم الصحية بجامعة بيتسبرغ في مستشفى UPMC للأطفال في بيتسبرغ للتسلسل مع شكر خاص لمديره ويليام ماكدونالد. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل مركز جامعة بيتسبرغ للحوسبة البحثية من خلال موارد الكمبيوتر المقدمة. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة رقم المنحة R35GM133732 (إلى S.J.H).

بيان الأخلاقيات: تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل المكتب المؤسسي لحماية البحوث في السلامة الأحيائية في جامعة بيتسبرغ.
1. إعداد الخرز المغناطيسي
ملاحظة: قم بإجراء عملية الفرز قبل فرز الخلايا واستمر في وضع الثلج حتى الاستخدام.
<ol><li>ماصة 30 ميكرولت...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT & RUN هو بروتوكول فعال لتحديد توطين البروتين على الكروماتين. لديها العديد من المزايا بالنسبة للبروتوكولات الأخرى ، بما في ذلك: 1) نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية ، 2) البروتوكول السريع ، و 3) تغطية قراءة التسلسل المنخفض المطلوبة مما يؤدي إلى توفير التكاليف. يتيح استخدام البروتين A أو البروت?...

تعمل العديد من البروتينات النووية من خلال التفاعل مع الكروماتين لتعزيز أو منع الأنشطة التي يتم تشكيلها بواسطة الحمض النووي. لتحديد وظيفة هذه البروتينات المتفاعلة مع الكروماتين ، من المهم تحديد المواقع الجينومية التي ترتبط بها هذه البروتينات. منذ تطويره في عام 1985 ، كان الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) هو المعيار الذهبي لتحديد المكان الذي يرتبط فيه البروتين بالكروماتين 1,2. تحتوي تقنية ChIP التقليدية على سير العمل الأساسي التالي: يتم حصاد الخلايا وترابطها (عادة مع الفورمالديهايد) ، ويتم قص الكروماتين (عادة بطرق صوتنة قاسية ، مما يستلزم الربط المتبادل) ، ويتم ترسيب البروتين محل الاهتمام باستخدام جسم مضاد يستهدف البروتين (أو البروتين الموسوم) متبوعا بجسم مضاد ثانوي (مقترن بالأغاروز أو الخرز المغناطيسي) ، ويتم عكس الربط المتبادل ، يتم هضم البروتين والحمض النووي الريبي لتنقية الحمض النووي ، ويتم استخدام هذا الحمض النووي المخصب ChIP كقالب للتحليل (باستخدام المجسات المشعة1,2 أو qPCR3 أو المصفوفات الدقيقة 5,6 أو التسلسل4). مع ظهور المصفوفات الدقيقة والتسلسل العميق المتوازي على نطاق واسع ، تم تطوير ChIP-chip 5,6 و ChIP-seq4 مؤخرا والسماح بتحديد توطين البروتين على الكروماتين على نطاق الجينوم. لقد كان الربط المتقاطع ChIP تقنية قوية وموثوقة منذ ظهوره مع تقدم كبير في الدقة بواسطة ChIP-exo7 و ChIP-nexus8. بالتوازي مع تطوير ChIP-seq ، تم إنشاء بروتوكولات أصلية (غير متقاطعة) ل ChIP (N-ChIP) ، والتي تستخدم هضم النوكليز (غالبا باستخدام nuclease المكورات الدقيقة أو MNase) لتفتيت الكروماتين ، بدلا من الصوتنة التي يتم إجراؤها في تقنيات ChIP التقليدية المتشابكة9. ومع ذلك ، فإن أحد العيوب الرئيسية لكل من تقنيات ChIP و N-ChIP المتقاطعة هو الحاجة إلى أعداد عالية من الخلايا بسبب انخفاض إنتاجية الحمض النووي بعد التلاعب التجريبي. لذلك ، في السنوات الأخيرة ، كانت العديد من الجهود المبذولة نحو تحسين تقنيات ChIP لمدخلات الخلايا المنخفضة. وقد أسفرت هذه الجهود عن تطوير العديد من التقنيات القوية القائمة على ChIP والتي تختلف في قابلية تطبيقها ومتطلبات المدخلات 10،11،12،13،14،15،16،17،18. ومع ذلك ، كانت التقنيات القائمة على ChIP-seq أحادية الخلية غير موجودة ، خاصة بالنسبة للبروتينات غير الهيستونية.
في عام 2004 ، تم تطوير تقنية بديلة لتحديد إشغال البروتين على الكروماتين يسمى الانقسام الداخلي للكروماتين (ChEC) والانقسام المناعي للكروماتين (ChIC)19. تستخدم تقنيات الموضع الواحد هذه اندماج MNase إما مع البروتين محل الاهتمام (ChEC) أو البروتين A (ChIC) للقطع المباشر للحمض النووي المجاور للبروتين محل الاهتمام. في السنوات الأخيرة ، تم تحسين كل من ChEC و ChIC لتنميط البروتين على مستوى الجينوم على الكروماتين (ChEC-seq و CUT & RUN ، على التوالي) 20،21. في حين أن ChEC-seq هي تقنية قوية لتحديد توطين العوامل ، إلا أنها تتطلب تطوير بروتينات MNase-fusion لكل هدف ، في حين أن ChIC واختلافه على نطاق الجينوم ، CUT & RUN ، يعتمدان على جسم مضاد موجه نحو البروتين محل الاهتمام (كما هو الحال مع ChIP) والبروتين المؤتلف A-MNase ، حيث يمكن للبروتين A التعرف على المنطقة الثابتة IgG من الجسم المضاد. كبديل ، تم تطوير بروتين الانصهار A / Protein G-MNase (pA / G-MNase) الذي يمكنه التعرف على مجموعة أوسع من المناطق الثابتة للأجسام المضادة22. سرعان ما أصبح CUT & RUN بديلا شائعا ل ChIP-seq لتحديد توطين البروتين على مستوى جينوم الكروماتين.
تم وصف الإدخال المنخفض للغاية CUT & RUN (uliCUT & RUN) ، وهو شكل مختلف من CUT & RUN يتيح استخدام مدخلات منخفضة وأحادية الخلية ، في 201923. هنا ، يتم وصف منهجية تطبيق يدوي أحادي الخلية بتنسيق 96 بئرا. من المهم ملاحظة أنه منذ تطوير uliCUT & RUN ، تم تطوير بديلين لتنميط الهيستون ، CUT & Tag و iACT-seq ، مما يوفر تنميطا قويا ومتوازيا للغاية لبروتينات الهيستون24,25. علاوة على ذلك ، تم تحسين scCUT & Tag لتنميط عوامل متعددة في خلية واحدة (multiCUT & Tag) وللتطبيق على بروتينات غير هيستون26. معا ، يوفر CUT & RUN بديلا جذابا ل ChIP-seq منخفض الإدخال حيث يمكن إجراء uliCUT & RUN في أي مختبر للبيولوجيا الجزيئية يمكنه الوصول إلى فارز الخلايا والمعدات القياسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

يعد تحديد مواقع ربط البروتين على الكروماتين أمرا ضروريا لفهم وظيفته وأهدافه التنظيمية المحتملة. كان الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) هو المعيار الذهبي لتحديد توطين البروتين لأكثر من 30 عاما ويتم تعريفه من خلال استخدام جسم مضاد لسحب البروتين محل الاهتمام من الكروماتين الصوتي أو المهضوم إنزيميا. في الآونة الأخيرة ، أصبحت تقنيات ربط الأجسام المضادة شائعة لتقييم توطين البروتين على الكروماتين بسبب حساسيتها المتزايدة. الانقسام تحت الأهداف والإطلاق تحت النوكليز (CUT & RUN) هو مشتق على مستوى الجينوم من الانقسام المناعي للكروماتين (ChIC) ويستخدم البروتين المؤتلف A المربوط بالمكورات الدقيقة nuclease (pA-MNase) لتحديد منطقة ثابتة IgG من الجسم المضاد الذي يستهدف بروتينا ذا أهمية ، وبالتالي تمكين الانقسام الخاص بالموقع للحمض النووي المحيط بالبروتين محل الاهتمام. يمكن استخدام CUT & RUN لتحديد ملامح تعديلات الهيستون وعوامل النسخ وغيرها من البروتينات المرتبطة بالكروماتين مثل عوامل إعادة تشكيل النيوكليوسومات. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام CUT & RUN لتقييم توطين البروتينات المرتبطة ب euchromatic أو heterochromatic وتعديلات الهيستون. لهذه الأسباب ، يعد CUT & RUN طريقة قوية لتحديد ملفات تعريف الارتباط لمجموعة واسعة من البروتينات. في الآونة الأخيرة ، تم تحسين CUT & RUN لتنميط عامل النسخ في مجموعات منخفضة من الخلايا والخلايا المفردة ، وقد أطلق على البروتوكول الأمثل اسم CUT & RUN منخفض للغاية (uliCUT & RUN). هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتنميط عامل الخلية الواحدة باستخدام uliCUT & RUN بتنسيق يدوي 96-well.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتنميط البروتين أحادي الخلية على الكروماتين باستخدام تنسيق يدوي 96-well uliCUT & RUN. في حين أن النتائج ستختلف بناء على البروتين الذي يتم تعريفه (بسبب وفرة البروتين وجودة الأجسام المضادة) ، ونوع الخلية ، والعوامل المساهمة الأخرى ، تتم مناقشة النتائج المتوقعة لهذه الت?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

يمكن استخدام CUT & RUN ومتغيراته لتحديد إشغال البروتين على الكروماتين. يصف هذا البروتوكول كيفية تحديد توطين البروتين على الكروماتين باستخدام uliCUT & RUN أحادي الخلية.

توطين عامل الخلية الواحدة على الكروماتين باستخدام انقسام المدخلات المنخفض للغاية تحت الأهداف والإطلاق باستخدام Nuclease

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT & RUN هي تقنية قوية لتحديد توطين البروتين على الكروماتين ، وهنا نصف نسخة أحادية الخلية من هذه التقنية بتنسيق يدوي 96 بئرا. تتطلب معظم تقنيات توطين البروتين ، مثل ChIP-seq ، مدخلات عالية من الخلايا وتستغرق حوالي ثلاثة أيام لإكمالها. تم تحسين CUT & RUN ، بسبب الإشارة العالية والخلفية المنخفضة ، للتطبيق منخفض الخلية وخلية واحدة ، ويمكن إكماله في يوم واحد.نحن نتصور أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على أي عينة بيولوجية تقريبا ويمكن أن تكون قوية بشكل خاص لتحديد توطين العوامل في العينات النادرة ومنخفضة الوفرة ، مثل عينات المرضى الثمينة. قبل إجراء أي تجارب أحادية الخلية ، اختبر الجسم المضاد والتقنية على عدد كبير من الخلايا غير الثمينة. القيد الرئيسي لهذه التجربة هو الاعتماد على جسم مضاد قوي.يوضح الإجراء سانتانا لاردو ، أخصائي أبحاث متمرس من مختبري. بعد فرز الخلايا المفردة وربط النوى بالخرز ، ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا واسمح للخرز بالارتباط لمدة لا تقل عن خمس دقائق. ثم ، قم بإزالة وتجاهل supernatant.أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع إلى الخرز المرتبط بالنواة ، واخلطه مع السحب اللطيف ، واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا واسمح للجهاز الفائق بالتفريغ لمدة لا تقل عن خمس دقائق. ثم ، قم بإزالة وتجاهل supernatant دون إزعاج الخرز.قم بإزالة اللوحة من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل تفاعل باستخدام السحب اللطيف. ضع اللوحة مرة أخرى على الرف المغناطيسي الذي يبلغ طوله 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالتنظيف ، ثم قم بإزالة السطح والتخلص منه. أعد تعليق الخرز في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل تفاعل باستخدام السحب اللطيف.اصنع خليطا رئيسيا أوليا للأجسام المضادة عن طريق اقتباس 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل تفاعل ثم أضف 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لكل تفاعل. أضف 25.5 ميكرولتر من المزيج العازل لغسول الأجسام المضادة ، متبوعا بسحب لطيف لكل عينة يتم معالجتها بجسم مضاد يستهدف البروتين محل الاهتمام. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.ثم ، ضع العينات مرة أخرى على الرف المغناطيسي الذي يبلغ طوله 96 بئرا. بمجرد أن يصبح السوبرناتانت واضحا ، قم بإزالته والتخلص منه دون إزعاج الخرز. بعد إزالة اللوحة من الرف المغناطيسي ، اغسل الخرز ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وأعد تعليقه عن طريق السحب.بعد وضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا والتخلص من supernatant كما هو موضح سابقا ، أعد تعليق كل عينة في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل. اصنع خليط رئيسي من البروتين A MNase عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وكمية محسنة من البروتين A MNase لكل تفاعل. أضف 25 ميكرولتر من خليط البروتين A MNase الرئيسي إلى كل عينة، بما في ذلك عينات التحكم.احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا. اسمح للسوبرناتانت بالتنظيف لمدة لا تقل عن خمس دقائق ثم قم بإزالة والتخلص من السوبرناتانت دون إزعاج الخرز.بعد إزالة اللوحة من الرف المغناطيسي ، اغسل الخرز ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وأعد تعليقه عن طريق السحب اللطيف. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا وتخلص من السوبرناتانت كما هو موضح سابقا. ثم قم بإزالة العينات من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل عن طريق السحب اللطيف.قم بموازنة العينات إلى صفر درجة مئوية في خليط ماء مثلج لمدة خمس دقائق ثم قم بإزالة العينات من حمام الماء المثلج. أضف ميكرولتر واحد من كلوريد الكالسيوم 100 مللي مولا باستخدام ماصة متعددة القنوات. اخلطي جيدا ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات كبيرة الحجم ثم أعيدي العينات إلى صفر درجة مئوية.ابدأ تشغيل مؤقت لمدة 10 دقائق بمجرد عودة اللوحة إلى حمام الماء المثلج. أوقف التفاعل عن طريق سحب 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على ضعف تركيز RSTOP+، وقم بالتخزين المؤقت في كل بئر بنفس ترتيب إضافة كلوريد الكالسيوم. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.قم بتدوير الطبق عند 16،000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا. اسمح للسوبرنات بالمسح لمدة لا تقل عن خمس دقائق.بعد ذلك ، انقل السوبرناتونات إلى طبق جديد من 96 بئرا وتخلص من الخرز. لاستخراج الحمض النووي ، أضف ميكرولتر واحد من 10٪ SDS و 0.83 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل ملليلتر بروتين K إلى كل عينة واخلط العينات عن طريق السحب اللطيف. احتضان العينات لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية.أعد اللوحة إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 46.6 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم الخماسي المولي و 90 ميكرولتر من 50٪ PEG4000 واخلطها عن طريق السحب اللطيف. أضف 33 ميكرولتر من حبات المغنطيسية البوليسترين إلى كل عينة واحتضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.ضع اللوحة على رف مغناطيسي واسمح للطبقة الفائقة بالإزالة لمدة خمس دقائق تقريبا. ثم ، تخلص بعناية من supernatant دون إزعاج الخرز. شطف مرتين مع 150 ميكرولتر من 80 ٪ من الإيثانول دون إزعاج الخرز.قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 1000 مرة G لمدة 30 ثانية. ضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا وقم بإزالة جميع الإيثانول المتبقي دون إزعاج الخرز. جفف العينات بالهواء لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.أعد تعليق الخرز في 37.5 ميكرولتر من هيدروكلوريد TRIS 10 ملليمولار من الرقم الهيدروجيني 8 واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي واترك الخرز يرتبط لمدة خمس دقائق. انقل 36.5 ميكرولتر من السوبرناتانت إلى طبق 96 بئر جديد متوافق مع الدراجة الحرارية وتخلص من الخرز.بعد إجراء تقييم جودة الخلية ، تم فحص مظهر الخلية والنسبة المئوية ، مما يدل على أنه لا ينبغي استخدام الخلايا الجذعية الجنينية منخفضة الجودة. تم إجراء فرز خلية واحدة باستخدام صبغة Hoechst 33342 ، وتم حساب خلايا الاختبار لضمان وجود خلية صفر أو خلية واحدة في كل بئر. كشف تحليل هلام Agarose عن سلم وزن جزيئي منخفض ومكتبات uliCUT & RUN فردية أحادية الخلية.يظهر تحليل المكتبة دون المستوى الأمثل والأمثل سلما منخفضا للوزن الجزيئي ، ومكتبة دون المستوى الأمثل بسبب هضم Mnase غير الفعال ، ومكتبة ناجحة مع عملية هضم مناسبة. يوضح توزيع محلل الأجزاء أن الحجم المتوقع للخلية الواحدة يتراوح من 150 إلى 500 زوج قاعدة. ومع ذلك ، في البروتينات الكبيرة ، سيكون للحمض النووي حوالي 270 زوجا أساسيا.كشف إشغال البروتين باستخدام متصفح الجينوم أحادي الموضع الذي يصور عددا كبيرا من الخلايا أو التحكم السلبي و CTCF uliCUT & RUN أحادي الخلية أن الخلية الواحدة تمثل إلى حد كبير قمم قوية ، على غرار uliCUT & RUN عالي الخلية. كشفت الخرائط الحرارية ل CTCF أحادي الخلية أو التحكم السلبي عن نمط واضح من إثراء القراءة مباشرة عبر مواقع ربط CTCF الراسخة في الخلايا. تظهر الخرائط الحرارية أحادية البعد كثافة قراءة أعلى على مواقع ربط CTCF القائمة في مكتبات الخلية الواحدة بالنسبة للمناطق المحيطة وضوابط عدم وجود أجسام مضادة ، مما يدل على التخصيب الخاص بالأجسام المضادة في مواقع التجليد الثابتة.من المهم موازنة النوى المرتبطة بالخرز في حمام الماء المثلج وعدم ارتفاع درجة حرارة العينة عند إضافة كلوريد الكالسيوم لمنع الإفراط في هضم الكروماتين.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

لونين مناعي (رقاقة) باستخدام ذبابة الفاكهة الأنسجة

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

جيل من البلازميد ناقلات معربا عن بروتينات الموسومة FLAG تحت تنظيم الاستطالة الإنسان عامل-1α المروج عن طريق الجمعية جيبسون

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

تطبيقات أحادية التحقيق: وسائل التصوير الطيفي والتحليل خلية واحدة في ظل الظروف المحيطة

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...