Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Hainer Lab for at have læst og kommenteret en tidligere version af dette manuskript. Dette projekt brugte NextSeq500 tilgængelig på University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core på UPMC Children's Hospital of Pittsburgh til sekventering med særlig tak til sin direktør, William MacDonald. Denne forskning blev delvist støttet af University of Pittsburgh Center for Research Computing gennem de leverede computerressourcer. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (til S.J.H.).

Etisk erklæring: Alle undersøgelser blev godkendt af Institutional Biosafety Office of Research Protections ved University of Pittsburgh.
1. Forbered magnetiske perler
BEMÆRK: Udfør før cellesortering og hold på is indtil brug.
<ol><li>Pipette 30 μL ConA-konjugerede paramagnetiske mikrosfærer perleopslæmning blandes pr. reaktion på et frisk 1,5 ml mikrofugerør og tilsættes 850 μL bindingsbuffer, pipetteres forsigtigt for at blande.<br...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN er en effektiv protokol til bestemmelse af proteinlokalisering på kromatin. Det har mange fordele i forhold til andre protokoller, herunder: 1) højt signal-støj-forhold, 2) hurtig protokol og 3) lav sekventeringsaflæsningsdækning, hvilket fører til omkostningsbesparelser. Brugen af protein A- eller protein A/G-MNase gør det muligt at anvende CUT&RUN med ethvert tilgængeligt antistof; derfor har det potentialet til hurtigt og nemt at profilere mange proteiner. Tilpasning til enkeltcelle til enhver proteinp...

Mange nukleare proteiner fungerer ved at interagere med kromatin for at fremme eller forhindre DNA-skabelonerede aktiviteter. For at bestemme funktionen af disse kromatin-interagerende proteiner er det vigtigt at identificere de genomiske steder, hvor disse proteiner er bundet. Siden udviklingen i 1985 har Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) været guldstandarden til at identificere, hvor et protein binder sig til kromatin 1,2. Den traditionelle ChIP-teknik har følgende grundlæggende arbejdsgang: celler høstes og tværbundes (normalt med formaldehyd), kromatin skæres (normalt med hårde sonikeringsmetoder, hvilket nødvendiggør tværbinding), proteinet af interesse immunudfældes ved hjælp af et antistof, der er målrettet mod proteinet (eller mærket protein) efterfulgt af et sekundært antistof (koblet til agarose eller magnetiske perler), tværbinding vendes, protein og RNA fordøjes for at rense DNA, og dette ChIP-berigede DNA bruges som skabelon til analyse (ved hjælp af radioaktivt mærkede sonder 1,2, qPCR3, mikroarrays 5,6 eller sekventering4). Med fremkomsten af mikroarrays og massivt parallel dyb sekventering er ChIP-chip 5,6 og ChIP-seq4 for nylig blevet udviklet og giver mulighed for genom-bred identifikation af proteinlokalisering på kromatin. Crosslinking ChIP har været en kraftfuld og pålidelig teknik siden dens fremkomst med store fremskridt inden for opløsning af ChIP-exo7 og ChIP-nexus8. Parallelt med udviklingen af ChIP-seq er der etableret indfødte (ikke-tværbindende) protokoller for ChIP (N-ChIP), som udnytter nukleasefordøjelsen (ofte ved hjælp af mikrokoknuklease eller MNase) til at fragmentere kromatinen i modsætning til sonikering udført i traditionelle tværbinding ChIP-teknikker9. En stor ulempe ved både tværbinding af ChIP- og N-ChIP-teknologier har imidlertid været kravet om høje celletal på grund af lavt DNA-udbytte efter den eksperimentelle manipulation. Derfor har mange bestræbelser i de senere år været rettet mod at optimere ChIP-teknologier til lavt celleinput. Disse bestræbelser har resulteret i udviklingen af mange kraftfulde ChIP-baserede teknologier, der varierer i deres anvendelighed og inputkrav 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Imidlertid har enkeltcellede ChIP-seq-baserede teknologier manglet, især for ikke-histonproteiner.
I 2004 blev der udviklet en alternativ teknologi til bestemmelse af proteinbelægning på kromatin betegnet Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) og Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Disse single-locus teknikker udnytter en fusion af MNase til enten proteinet af interesse (ChEC) eller til protein A (ChIC) til direkte skæring af DNA ved siden af proteinet af interesse. I de senere år er både ChEC og ChIC blevet optimeret til genom-dækkende proteinprofilering på kromatin (henholdsvis ChEC-seq og CUT&RUN)20,21. Mens ChEC-seq er en kraftfuld teknik til bestemmelse af faktorlokalisering, kræver det udvikling af MNase-fusionsproteiner til hvert mål, mens ChIC og dets genom-brede variation, CUT&RUN, er afhængige af et antistof rettet mod proteinet af interesse (som med ChIP) og rekombinant protein A-MNase, hvor protein A kan genkende IgG-konstantområdet af antistoffet. Som et alternativ er der udviklet et fusionsprotein A/protein G-MNase (pA/G-MNase), der kan genkende en bredere vifte af antistofkonstantområder22. CUT&RUN er hurtigt blevet et populært alternativ til ChIP-seq til bestemmelse af proteinlokalisering på kromatingenomet.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), en variation af CUT&RUN, der gør det muligt at bruge lave og enkeltcellede input, blev beskrevet i 201923. Her beskrives metoden til en manuel enkeltcelleapplikation i 96-brønds format. Det er vigtigt at bemærke, at der siden udviklingen af uliCUT&RUN er udviklet to alternativer til histonprofilering, CUT&Tag og iACT-seq, hvilket giver robust og meget parallel profilering af histonproteiner24,25. Desuden er scCUT&Tag optimeret til profilering af flere faktorer i en enkelt celle (multiCUT&Tag) og til påføring på ikke-histonproteiner26. Tilsammen udgør CUT&RUN et attraktivt alternativ til ChIP-seq med lavt input, hvor uliCUT&RUN kan udføres i ethvert molekylærbiologisk laboratorium, der har adgang til cellesortering og standardudstyr.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Bestemmelse af bindingsstederne for et protein på kromatin er afgørende for at forstå dets funktion og potentielle lovgivningsmæssige mål. Kromatinimmunfældning (ChIP) har været guldstandarden til bestemmelse af proteinlokalisering i over 30 år og defineres ved anvendelse af et antistof til at trække proteinet af interesse ud af sonikeret eller enzymatisk fordøjet kromatin. For nylig er antistofbindingsteknikker blevet populære til vurdering af proteinlokalisering på kromatin på grund af deres øgede følsomhed. Spaltning under mål og frigivelse under nuklease (CUT &RUN) er det genom-brede derivat af Chromatin Immunocleavage (ChIC) og anvender rekombinant protein A bundet til mikrokoknuklease (pA-MNase) til at identificere IgG-konstantområdet af antistoffet rettet mod et protein af interesse, hvilket muliggør stedsspecifik spaltning af DNA'et, der flankerer proteinet af interesse. CUT & RUN kan bruges til at profilere histonmodifikationer, transkriptionsfaktorer og andre kromatinbindende proteiner såsom nukleosomombygningsfaktorer. Det er vigtigt, at CUT&RUN kan bruges til at vurdere lokaliseringen af enten eukromatiske eller heterokromatiske associerede proteiner og histonmodifikationer. Af disse grunde er CUT&RUN en kraftfuld metode til bestemmelse af bindingsprofilerne for en lang række proteiner. For nylig er CUT&RUN blevet optimeret til transkriptionsfaktorprofilering i lave populationer af celler og enkeltceller, og den optimerede protokol er blevet betegnet ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN). Her præsenteres en detaljeret protokol til enkeltcellefaktorprofilering ved hjælp af uliCUT &RUN i et manuelt 96-brønds format.

Her præsenteres en detaljeret protokol for enkeltcelleproteinprofilering på kromatin ved hjælp af et 96-brønds manuelt format uliCUT & RUN. Mens resultaterne vil variere afhængigt af det protein, der profileres (på grund af proteinoverflod og antistofkvalitet), celletype og andre bidragende faktorer, diskuteres forventede resultater for denne teknik her. Cellekvalitet (celleudseende og procentdel af levedygtige celler) og enkeltcellesortering bør vurderes før eller på tidspunktet for levende cellesortering i NE-...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN og dets varianter kan bruges til at bestemme proteinbelægning på kromatin. Denne protokol beskriver, hvordan man bestemmer proteinlokalisering på kromatin ved hjælp af enkeltcelle uliCUT & RUN.

Lokalisering af enkeltcellefaktor på kromatin ved hjælp af ultralav indgangsspaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN er en kraftfuld teknik til bestemmelse af proteinlokalisering på kromatin, og her beskriver vi en enkeltcelleversion af denne teknik i et manuelt 96-brønds format. De fleste proteinlokaliseringsteknikker, som ChIP-seq, kræver høj celleindgang og tager cirka tre dage at gennemføre. CUT&RUN er på grund af det høje signal og den lave baggrund optimeret til lavcelle- og enkeltcelleapplikation og kan gennemføres på en enkelt dag.Vi forestiller os, at denne teknik kan anvendes på næsten enhver biologisk prøve og kan være særlig kraftfuld til at bestemme faktorlokalisering i sjældne og lav-abundance prøver, såsom dyrebare patientprøver. Før du udfører enkeltcelleeksperimenter, skal du teste antistoffet og teknikken på et stort antal ikke-dyrebare celler. Hovedbegrænsningen ved dette eksperiment er afhængigheden af et robust antistof.Santana Lardo, en erfaren forskningsspecialist fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Efter sortering af enkeltceller og binding af kerner til perler skal du placere pladen med 96 brønde på et magnetisk stativ med 96 brønde og lade perlerne binde i mindst fem minutter. Fjern derefter og kassér supernatanten.Tilsæt 100 mikroliter blokerende buffer til de kernebundne perler, bland med blid pipettering og inkuber i fem minutter ved stuetemperatur. Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, og lad supernatanten rydde i mindst fem minutter. Fjern og kassér derefter supernatanten uden at forstyrre perlerne.Fjern pladen fra magnetstativet, og ophæng perlerne igen i 100 mikroliter vaskebuffer pr. reaktion med skånsom pipettering. Placer pladen tilbage på det magnetiske stativ med 96 brønde, lad supernatanten rydde, og fjern og kassér derefter supernatanten. Resuspend perlerne i 25 mikroliter vaskebuffer pr. reaktion med skånsom pipettering.Lav en primær antistofmasterblanding ved at alicitere 25 mikroliter vaskebuffer pr. reaktion og tilsæt derefter 0,5 mikroliter antistof pr. reaktion. Der tilsættes 25,5 mikroliter af antistofvaskebufferblandingen efterfulgt af skånsom pipettering til hver prøve, der behandles med et antistof rettet mod det protein, der er af interesse. Inkuber i en time ved stuetemperatur.Placer derefter prøverne igen tilbage på det magnetiske stativ med 96 brønde. Når supernatanten er klar, skal du fjerne og kassere den uden at forstyrre perler. Når pladen er fjernet fra magnetstativet, vaskes perlerne med 100 mikroliter vaskebuffer og suspenderes igen ved pipettering.Efter at have lagt pladen tilbage på et magnetisk stativ med 96 brønde og kasseret supernatant som tidligere påvist, skal hver prøve genanvendes i 25 mikroliter vaskebuffer. Lav et protein A MNase master blanding ved at tilføje 25 mikroliter vaskebuffer og en optimeret mængde protein A MNase pr. Reaktion. Der tilsættes 25 mikroliter protein A MNase masterblanding til hver prøve, herunder kontrolprøverne.Inkuber prøverne i 30 minutter ved stuetemperatur. Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde. Lad supernatanten rydde i mindst fem minutter, og fjern og kassér derefter supernatanten uden at forstyrre perlerne.Når du har fjernet pladen fra magnetstativet, vaskes perlerne med 100 mikroliter vaskebuffer og suspenderes igen ved blid pipettering. Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, og kassér supernatanten som tidligere påvist. Fjern derefter prøverne fra magnetstativet, og ophæng perlerne igen i 50 mikroliter vaskebuffer ved blid pipettering.Ligevægt prøverne til nul grader Celsius i en isvandsblanding i fem minutter, og prøverne fjernes derefter fra isvandbadet. Tilsæt en mikroliter 100 millimolært calciumchlorid ved hjælp af en flerkanalspipette. Bland godt tre til fem gange med skånsom pipettering ved hjælp af en flerkanalspipette med stort volumen, og returner derefter prøverne til nul grader Celsius.Start en 10 minutters timer, så snart pladen er tilbage i isvandbadet. Reaktionen stoppes ved at pipettere 50 mikroliter af en opløsning indeholdende dobbelt så stor koncentration af RSTOP+ og buffer i hver brønd i samme rækkefølge, som calciumchloridet blev tilsat. Inkubere prøverne i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Drej pladen ved 16.000 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde. Lad supernatanten rydde i mindst fem minutter.Overfør derefter supernatanter til en frisk 96-brønds plade og kassér perlerne. Til DNA-ekstraktion tilsættes en mikroliter på 10% SDS og 0,83 mikroliter 20 milligram pr. Milliliter proteinase K til hver prøve og bland prøverne ved blid pipettering. Inkuber prøverne i 10 minutter ved 70 grader Celsius.Returner pladen til stuetemperatur. Der tilsættes 46,6 mikroliter femmolært natriumchlorid og 90 mikroliter 50 % PEG4000 og blandes ved skånsom pipettering. Tilsæt 33 mikroliter polystyrenmagnetitperler til hver prøve og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.Placer pladen på et magnetisk stativ, og lad supernatanten rydde i omkring fem minutter. Kassér derefter forsigtigt supernatanten uden at forstyrre perlerne. Skyl to gange med 150 mikroliter 80% ethanol uden at forstyrre perlerne.Drej pladen kort ved 1000 gange G i 30 sekunder. Placer pladen tilbage på et magnetisk stativ med 96 brønde, og fjern al resterende ethanol uden at forstyrre perlerne. Lufttør prøverne i omkring to til fem minutter.Resuspend perlerne i 37,5 mikroliter 10 millimolært TRIS-hydrochlorid af pH 8 og inkuber i fem minutter ved stuetemperatur. Placer pladen tilbage på et magnetisk stativ, og lad perlerne binde i fem minutter. Overfør 36,5 mikroliter supernatanten til en frisk termocyklistkompatibel 96-brønds plade, og kassér perlerne.Efter at have udført cellekvalitetsvurdering blev celleudseende og procentdel undersøgt, hvilket viste, at embryonale stamceller af lav kvalitet ikke bør anvendes. Enkeltcellesortering blev udført ved hjælp af Hoechst 33342-plet, og testcellerne blev talt for at sikre, at enten nul eller en celle findes i hver brønd. Agarosegelanalyse afslørede en lavmolekylær stige og individuelle enkeltcelle uliCUT & RUN biblioteker.Suboptimal og optimal biblioteksanalyse viser en lavmolekylær vægtstige, suboptimalt bibliotek på grund af ineffektiv Mnase-fordøjelse og vellykket bibliotek med passende fordøjelse. Fragmentanalysatorfordeling viser, at den forventede størrelse af enkeltcelle varierer fra 150 til 500 basepar. Men i store proteiner vil DNA have omkring 270 basepar.Proteinbelægning ved hjælp af single-locus genombrowser, der viser højt celletal eller negativ kontrol, og enkeltcelle CTCF uliCUT & RUN afslørede, at enkeltcelle stort set repræsenterede stærke toppe, svarende til højcellet uliCUT & RUN. Varmekort over enkeltcelle CTCF eller negativ kontrol afslørede et klart mønster af læseberigelse direkte over etablerede CTCF-bindingssteder i cellerne. Endimensionelle varmekort viser en højere læsetæthed over etablerede CTCF-bindingssteder i enkeltcellebiblioteker i forhold til omgivende regioner og ikke-antistofkontroller, hvilket viser antistofspecifik berigelse på etablerede bindingssteder.Det er vigtigt at udligne de perlebundne kerner på isvandbadet og ikke overophede prøven ved tilsætning af calciumchlorid for at forhindre overfordøjelse af kromatinet.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionel Profilering af Voksen Mouse cardiomyocytter

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Chromatin Immunopræcipitation (CHIP) under anvendelse af Drosophila Væv

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization brug af foto-aktiverede Localization mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Effektiv Kromatin Immunoprecipitation hjælp Begrænsning mængder biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation af Plasmidvektorer udtrykker FLAG-mærkede proteiner henhold til forordningen for Human elongeringsfaktor-1α Promoter Brug Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering af specifikke genomiske regioner og Identifikation af associerede molekyler ved enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Anvendelser af Single-sonde: massespektrometri Imaging og Single Cell Analysis under omgivende betingelser

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantificering af lokationsspecifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometrisk ved hjælp af Data-uafhængig erhvervelse massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...