Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

We bedanken leden van het Hainer Lab voor het lezen en becommentariëren van een eerdere versie van dit manuscript. Dit project gebruikte de NextSeq500 beschikbaar bij de University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core in het UPMC Children's Hospital of Pittsburgh voor sequencing met speciale dank aan de directeur, William MacDonald. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het University of Pittsburgh Center for Research Computing via de verstrekte computerbronnen. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (aan S.J.H.).

Ethische verklaring: Alle studies werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Office of Research Protections aan de Universiteit van Pittsburgh.
1. Bereid magnetische kralen voor
OPMERKING: Voer uit voordat u de cel sorteert en houd ijs vast tot gebruik.
<ol><li>Pipetteer 30 μL conA-geconjugeerde paramagnetische microsferen pareldrijfmestmengsel per reactie op een verse microfugebuis van 1,5 ml en voeg 850 μL bindingsbuffer toe, pipettee...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN is een effectief protocol om eiwitlokalisatie op chromatine te bepalen. Het heeft veel voordelen ten opzichte van andere protocollen, waaronder: 1) hoge signaal-ruisverhouding, 2) snel protocol en 3) lage sequencing leesdekking vereist, wat leidt tot kostenbesparingen. Het gebruik van Protein A- of Protein A/G-MNase maakt het mogelijk om CUT&RUN toe te passen met elk beschikbaar antilichaam; daarom heeft het de potentie om snel en gemakkelijk veel eiwitten te profileren. Aanpassing aan eencellige voor elke eiwitp...

Veel nucleaire eiwitten functioneren door interactie met chromatine om DNA-gemodelleerde activiteiten te bevorderen of te voorkomen. Om de functie van deze chromatine-interagerende eiwitten te bepalen, is het belangrijk om de genomische locaties te identificeren waarop deze eiwitten gebonden zijn. Sinds de ontwikkeling in 1985 is Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) de gouden standaard om te bepalen waar een eiwit bindt aan chromatine 1,2. De traditionele ChIP-techniek heeft de volgende basisworkflow: cellen worden geoogst en gecrosslinkt (meestal met formaldehyde), chromatine wordt geschoren (meestal met agressieve ultrasoonapparaatmethoden, waardoor crosslinking nodig is), het eiwit van belang wordt immunoprecipiteerd met behulp van een antilichaam dat zich richt op het eiwit (of gelabeld eiwit) gevolgd door een secundair antilichaam (gekoppeld aan agarose of magnetische kralen), crosslinking wordt omgekeerd, eiwit en RNA worden verteerd om DNA te zuiveren, en dit ChIP verrijkt-DNA wordt gebruikt als de sjabloon voor analyse (met behulp van radioactief gelabelde sondes 1,2, qPCR3, microarrays 5,6 of sequencing4). Met de komst van microarrays en massaal parallelle diepe sequencing, zijn ChIP-chip 5,6 en ChIP-seq4 recenter ontwikkeld en maken genoombrede identificatie van eiwitlokalisatie op chromatine mogelijk. Crosslinking ChIP is sinds zijn komst een krachtige en betrouwbare techniek met grote vooruitgang in resolutie door ChIP-exo7 en ChIP-nexus8. Parallel aan de ontwikkeling van ChIP-seq zijn native (niet-crosslinking) protocollen voor ChIP (N-ChIP) vastgesteld, die nucleasevertering gebruiken (vaak met behulp van microkokkennuclease of MNase) om het chromatine te fragmenteren, in tegenstelling tot ultrasoonapparaat uitgevoerd in traditionele crosslinking ChIP-technieken9. Een groot nadeel van zowel crosslinking ChIP- als N-ChIP-technologieën is echter de vereiste voor hoge celaantallen vanwege de lage DNA-opbrengst na de experimentele manipulatie. Daarom zijn er in meer recente jaren veel inspanningen geleverd om ChIP-technologieën te optimaliseren voor lage celinvoer. Deze inspanningen hebben geresulteerd in de ontwikkeling van vele krachtige ChIP-gebaseerde technologieën die variëren in hun toepasbaarheid en invoervereisten 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Eencellige ChIP-seq-gebaseerde technologieën ontbreken echter, vooral voor niet-histoneiwitten.
In 2004 werd een alternatieve technologie ontwikkeld om de eiwitbezetting te bepalen op chromatine genaamd Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) en Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Deze single-locus technieken maken gebruik van een fusie van MNase met het eiwit van belang (ChEC) of met eiwit A (ChIC) voor directe knip van DNA naast het eiwit van belang. In meer recente jaren zijn zowel ChEC als ChIC geoptimaliseerd voor genoombrede eiwitprofilering op chromatine (respectievelijk ChEC-seq en CUT&RUN)20,21. Hoewel ChEC-seq een krachtige techniek is voor het bepalen van factorlokalisatie, vereist het de ontwikkeling van MNase-fusie-eiwitten voor elk doelwit, terwijl ChIC en zijn genoombrede variatie, CUT & RUN, vertrouwen op een antilichaam gericht op het eiwit van belang (zoals bij ChIP) en recombinant eiwit A-MNase, waar het eiwit A het IgG-constante gebied van het antilichaam kan herkennen. Als alternatief is een fusie-eiwit A / Eiwit G-MNase (pA / G-MNase) ontwikkeld dat een breder scala aan antilichaamconstante regio's kan herkennen22. CUT&RUN is snel een populair alternatief geworden voor ChIP-seq voor het bepalen van eiwitlokalisatie op chromatine genoombreed.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), een variant van CUT&RUN die het gebruik van lage en single-cell ingangen mogelijk maakt, werd beschreven in 201923. Hier wordt de methodologie voor een handmatige 96-well formaat single-cell applicatie beschreven. Het is belangrijk op te merken dat sinds de ontwikkeling van uliCUT&RUN twee alternatieven voor histonprofilering, CUT&Tag en iACT-seq, zijn ontwikkeld, die robuuste en zeer parallelle profilering van histoneiwitten24,25 bieden. Bovendien is scCUT&Tag geoptimaliseerd voor het profileren van meerdere factoren in een enkele cel (multiCUT&Tag) en voor toepassing op niet-histoneiwitten26. Samen biedt CUT&RUN een aantrekkelijk alternatief voor ChIP-seq met lage input, waar uliCUT&RUN kan worden uitgevoerd in elk laboratorium voor moleculaire biologie dat toegang heeft tot een celsorteerder en standaardapparatuur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Het bepalen van de bindingslocaties van een eiwit op chromatine is essentieel voor het begrijpen van de functie en potentiële regulerende doelen. Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) is al meer dan 30 jaar de gouden standaard voor het bepalen van eiwitlokalisatie en wordt gedefinieerd door het gebruik van een antilichaam om het eiwit van belang uit gesoniseerd of enzymatisch verteerd chromatine te halen. Meer recent zijn antilichaam-tetheringtechnieken populair geworden voor het beoordelen van eiwitlokalisatie op chromatine vanwege hun verhoogde gevoeligheid. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) is het genoombrede derivaat van Chromatin Immunocleavage (ChIC) en maakt gebruik van recombinant Protein A vastgebonden aan micrococcebasnuclease (pA-MNase) om het IgG-constante gebied van het antilichaam te identificeren dat zich richt op een eiwit van belang, waardoor site-specifieke splitsing van het DNA mogelijk wordt dat het eiwit van belang flankeert. CUT & RUN kan worden gebruikt om histonmodificaties, transcriptiefactoren en andere chromatine-bindende eiwitten zoals nucleosoomremodelleringsfactoren te profileren. Belangrijk is dat CUT&RUN kan worden gebruikt om de lokalisatie van euchromatische of heterochromatische geassocieerde eiwitten en histonmodificaties te beoordelen. Om deze redenen is CUT&RUN een krachtige methode voor het bepalen van de bindingsprofielen van een breed scala aan eiwitten. Onlangs is CUT&RUN geoptimaliseerd voor transcriptiefactorprofilering in lage populaties van cellen en enkele cellen en het geoptimaliseerde protocol wordt ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN) genoemd. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor eencellige factorprofilering met behulp van uliCUT & RUN in een handmatig 96-well-formaat.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor eencellige eiwitprofilering op chromatine met behulp van een 96-well handmatig formaat uliCUT & RUN. Hoewel de resultaten zullen variëren op basis van het eiwit dat wordt geprofileerd (vanwege de overvloed aan eiwitten en de kwaliteit van antilichamen), celtype en andere bijdragende factoren, worden de verwachte resultaten voor deze techniek hier besproken. Celkwaliteit (celuitstraling en percentage levensvatbare cellen) en eencellige sortering moeten worden beoor...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT & RUN.

Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN is een krachtige techniek voor het bepalen van eiwitlokalisatie op chromatine, en hier beschrijven we een eencellige versie van deze techniek in een handmatig 96-well formaat. De meeste eiwitlokalisatietechnieken, zoals ChIP-seq, vereisen een hoge celinvoer en duren ongeveer drie dagen om te voltooien. CUT&RUN is vanwege het hoge signaal en de lage achtergrond geoptimaliseerd voor toepassingen met lage cellen en een cellen en kan in één dag worden voltooid.We stellen ons voor dat deze techniek kan worden toegepast op bijna elk biologisch monster en bijzonder krachtig kan zijn om factorlokalisatie te bepalen in zeldzame en weinig voorkomende monsters, zoals kostbare patiëntmonsters. Voordat u eencellige experimenten uitvoert, test u het antilichaam en de techniek op een groot aantal niet-kostbare cellen. De belangrijkste beperking van dit experiment is de afhankelijkheid van een robuust antilichaam.De procedure wordt gedemonstreerd door Santana Lardo, een ervaren onderzoeksspecialist uit mijn laboratorium. Na het sorteren van enkele cellen en het binden van kernen aan kralen, plaatst u de 96-well plaat op een 96-well magnetisch rek en laat u de kralen minimaal vijf minuten binden. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi het weg.Voeg 100 microliter blokkerende buffer toe aan de kerngebonden kralen, meng met zacht pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat het supernatant minimaal vijf minuten leegmaken. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi het weg zonder de kralen te storen.Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen per reactie opnieuw in 100 microliter wasbuffer per reactie met zacht pipetteren. Plaats de plaat terug op het magnetische rek met 96 putten, laat het supernatant wissen en verwijder en gooi het supernatant weg. Resuspend de kralen in 25 microliter wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.Maak een primair antilichaammastermengsel door 25 microliter wasbuffer per reactie te aliquoteren en voeg vervolgens 0,5 microliter antilichaam per reactie toe. Voeg 25,5 microliter van het antilichaamwasbuffermengsel toe, gevolgd door zacht pipetteren aan elk monster dat wordt behandeld met een antilichaam dat zich richt op het eiwit van belang. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur.Plaats de monsters vervolgens opnieuw op het magnetische rek met 96 putten. Zodra het supernatant helder is, verwijder en gooi het weg zonder storende kralen. Nadat u de plaat uit het magneetrek hebt verwijderd, wast u de kralen met 100 microliter wasbuffer en past u deze opnieuw op door pipetteren.Na het terugplaatsen van de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en het weggooien van supernatant zoals eerder aangetoond, resuspendeert u elk monster in 25 microliter wasbuffer. Maak een eiwit A MNase master mengsel door 25 microliter wasbuffer en een geoptimaliseerde hoeveelheid eiwit A MNase per reactie toe te voegen. Voeg 25 microliter eiwit A MNase-mastermengsel toe aan elk monster, inclusief de controlemonsters.Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten. Laat het supernatant minimaal vijf minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.Nadat u de plaat uit het magneetrek hebt verwijderd, wast u de kralen met 100 microliter wasbuffer en past u deze opnieuw aan door zacht pipetteren. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en gooi het supernatant weg zoals eerder gedemonstreerd. Verwijder vervolgens de monsters uit het magnetische rek en resuspend de kralen in 50 microliter wasbuffer door zacht te pipetteren.Breng de monsters gedurende vijf minuten in een ijswatermengsel op nul graden Celsius en verwijder vervolgens de monsters uit het ijswaterbad. Voeg een microliter calciumchloride van 100 millaris toe met behulp van een meerkanaalspipet. Meng drie tot vijf keer goed met zacht pipetteren met behulp van een meerkanaalspijlpipet met groot volume en breng de monsters vervolgens terug tot nul graden Celsius.Start een timer van 10 minuten zodra de plaat weer in het ijswaterbad ligt. Stop de reactie door 50 microliter van een oplossing met tweemaal de concentratie RSTOP+ te pipetteren en in elke put te bufferen in dezelfde volgorde als het calciumchloride werd toegevoegd. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.Draai de plaat vijf minuten op 16.000 keer G bij vier graden Celsius. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten. Laat het supernatant minimaal vijf minuten leegmaken.Breng vervolgens supernatanten over op een verse 96-well plaat en gooi de kralen weg. Voeg voor DNA-extractie één microliter van 10% SDS en 0,83 microliter van 20 milligram per milliliter proteïnase K toe aan elk monster en meng de monsters door zacht te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius.Breng de plaat terug op kamertemperatuur. Voeg 46,6 microliter natriumchloride met vijf molair en 90 microliter 50%PEG4000 toe en meng door voorzichtig pipetteren. Voeg 33 microliter polystyreenmagnetietparels toe aan elk monster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat het supernatant ongeveer vijf minuten leegmaken. Gooi vervolgens voorzichtig het bovennatuurlijke weg zonder de kralen te storen. Spoel tweemaal met 150 microliter 80% ethanol zonder de kralen te storen.Draai de plaat kort op 1000 keer G gedurende 30 seconden. Plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten en verwijder alle resterende ethanol zonder de kralen te verstoren. Droog de monsters ongeveer twee tot vijf minuten aan de lucht.Resuspend de kralen in 37,5 microliter 10-millimolair TRIS-hydrochloride van pH 8 en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat terug op een magnetisch rek en laat de kralen vijf minuten binden. Breng 36,5 microliter van het supernatant over op een verse thermocycler-compatibele 96-well plaat en gooi de kralen weg.Na het uitvoeren van een beoordeling van de celkwaliteit werden het uiterlijk en het percentage van de cel onderzocht, waaruit bleek dat embryonale stamcellen van lage kwaliteit niet mogen worden gebruikt. Eencellige sortering werd uitgevoerd met behulp van Hoechst 33342-kleuring en de testcellen werden geteld om ervoor te zorgen dat er nul of één cel in elke put wordt gevonden. Agarose-gelanalyse onthulde een ladder met een laag molecuulgewicht en individuele eencellige uliCUT & RUN-bibliotheken.Suboptimale en optimale bibliotheekanalyse toont een ladder met een laag molecuulgewicht, een suboptimale bibliotheek als gevolg van inefficiënte Mnase-vertering en een succesvolle bibliotheek met de juiste spijsvertering. Fragment analyzer distributie laat zien dat de verwachte grootte van eencellige varieert van 150 tot 500 basenparen. In grote eiwitten zal DNA echter ongeveer 270 basenparen hebben.Eiwitbezetting met behulp van single-locus genoombrowser met een hoog celnummer of negatieve controle en eencellige CTCF uliCUT & RUN onthulde dat eencellige grotendeels sterke pieken vertegenwoordigde, vergelijkbaar met hoogcellige uliCUT & RUN. Heatmaps van eencellige CTCF of negatieve controle onthulden een duidelijk patroon van leesverrijking direct over gevestigde CTCF-bindingsplaatsen in de cellen. Eendimensionale heatmaps tonen een hogere leesdichtheid over gevestigde CTCF-bindingsplaatsen in eencellige bibliotheken ten opzichte van omliggende regio's en controles zonder antilichamen, wat antilichaamspecifieke verrijking op gevestigde bindingsplaatsen aantoont.Het in evenwicht brengen van de parelgebonden kernen op het ijswaterbad en het niet oververhitten van het monster bij toevoeging van calciumchloride is belangrijk om oververtering van het chromatine te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generatie van plasmide vectoren die-FLAG tagged eiwitten onder de verordening van de Mens elongatiefactor-1α Promoter Met behulp van Gibson Vergadering

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Toepassingen van de single-probe: massaspectrometrie Imaging en Single Cell Analysis onder omgevingsomstandigheden

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...