Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Nous remercions les membres du Hainer Lab d’avoir lu et commenté une version antérieure de ce manuscrit. Ce projet a utilisé le NextSeq500 disponible au centre de séquençage des sciences de la santé de l’Université de Pittsburgh à l’hôpital pour enfants UPMC de Pittsburgh pour le séquençage, avec des remerciements particuliers à son directeur, William MacDonald. Cette recherche a été soutenue en partie par le Center for Research Computing de l’Université de Pittsburgh grâce aux ressources informatiques fournies. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (à S.J.H.).

Déclaration d’éthique : Toutes les études ont été approuvées par l’Institutional Biosafety Office of Research Protections de l’Université de Pittsburgh.
1. Préparez des perles magnétiques
REMARQUE: Effectuer avant le tri cellulaire et maintenir sur la glace jusqu’à l’utilisation.
<ol><li>Pipette 30 μL de microsphères paramagnétiques conjuguées ConA mélange de boue de billes par réaction à un tube de microfuge frais de 1,...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN est un protocole efficace pour déterminer la localisation des protéines sur la chromatine. Il présente de nombreux avantages par rapport aux autres protocoles, notamment: 1) un rapport signal/bruit élevé, 2) un protocole rapide et 3) une faible couverture de lecture de séquençage requise, ce qui entraîne des économies de coûts. L’utilisation de la protéine A- ou de la protéine A/G-MNase permet d’appliquer CUT&RUN avec n’importe quel anticorps disponible; par conséquent, il a le potentiel de pro...

De nombreuses protéines nucléaires fonctionnent en interagissant avec la chromatine pour promouvoir ou prévenir les activités modélisées par l’ADN. Pour déterminer la fonction de ces protéines interagissant avec la chromatine, il est important d’identifier les emplacements génomiques auxquels ces protéines sont liées. Depuis son développement en 1985, l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a été l’étalon-or pour identifier où une protéine se lie à la chromatine 1,2. La technique ChIP traditionnelle a le flux de travail de base suivant: les cellules sont récoltées et réticulées (généralement avec du formaldéhyde), la chromatine est cisaillée (généralement avec des méthodes de sonication sévères, nécessitant une réticulation), la protéine d’intérêt est immunoprécipitée à l’aide d’un anticorps qui cible la protéine (ou protéine marquée) suivie d’un anticorps secondaire (couplé à l’agarose ou aux billes magnétiques), la réticulation est inversée, les protéines et l’ARN sont digérés pour purifier l’ADN, et cet ADN enrichi en ChIP est utilisé comme modèle d’analyse (à l’aide de sondes radiomarquées 1,2, qPCR3, microréseaux 5,6 ou séquençage4). Avec l’avènement des microréseaux et du séquençage profond massivement parallèle, ChIP-chip 5,6 et ChIP-seq4 ont été développés plus récemment et permettent l’identification à l’échelle du génome de la localisation des protéines sur la chromatine. La réticulation ChIP est une technique puissante et fiable depuis son avènement avec des avancées majeures en résolution par ChIP-exo7 et ChIP-nexus8. Parallèlement au développement de ChIP-seq, des protocoles natifs (non réticulants) pour ChIP (N-ChIP) ont été établis, qui utilisent la digestion nucléase (souvent à l’aide de nucléase micrococcique ou MNase) pour fragmenter la chromatine, par opposition à la sonication effectuée dans les techniques ChIP traditionnelles de réticulation9. Cependant, l’un des principaux inconvénients des technologies chIP et N-ChIP de réticulation a été l’exigence d’un nombre élevé de cellules en raison du faible rendement en ADN à la suite de la manipulation expérimentale. Par conséquent, au cours des dernières années, de nombreux efforts ont été déployés pour optimiser les technologies ChIP pour un faible apport cellulaire. Ces efforts ont abouti au développement de nombreuses technologies puissantes basées sur le ChIP dont l’applicabilité et les besoins en intrantsvarient 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Cependant, les technologies à base de ChIP-seq unicellulaire ont fait défaut, en particulier pour les protéines non histones.
En 2004, une technologie de rechange a été mise au point pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine appelée clivage endogène de la chromatine (ChEC) et immunocléavage de la chromatine (ChIC)19. Ces techniques à locus unique utilisent une fusion de la MNase à la protéine d’intérêt (ChEC) ou à la protéine A (ChIC) pour la coupe directe de l’ADN adjacente à la protéine d’intérêt. Au cours des dernières années, ChEC et ChIC ont été optimisés pour le profilage protéique à l’échelle du génome sur la chromatine (ChEC-seq et CUT&RUN, respectivement)20,21. Bien que ChEC-seq soit une technique puissante pour déterminer la localisation des facteurs, elle nécessite le développement de protéines de fusion MNase pour chaque cible, tandis que ChIC et sa variation à l’échelle du génome, CUT&RUN, reposent sur un anticorps dirigé vers la protéine d’intérêt (comme avec ChIP) et la protéine A-MNase recombinante, où la protéine A peut reconnaître la région constante IgG de l’anticorps. Comme alternative, une protéine de fusion A / protéine G-MNase (pA / G-MNase) a été développée qui peut reconnaître une gamme plus large de régions constantes d’anticorps22. CUT&RUN est rapidement devenu une alternative populaire au ChIP-seq pour déterminer la localisation des protéines sur l’ensemble du génome de la chromatine.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), une variante de CUT&RUN qui permet l’utilisation d’entrées low et single-cell, a été décrite en 201923. Ici, la méthodologie pour une application manuelle à cellule unique au format 96 puits est décrite. Il est important de noter que depuis le développement d’uliCUT&RUN, deux alternatives pour le profilage des histones, CUT&Tag et iACT-seq ont été développées, fournissant un profilage robuste et hautement parallèle des protéines d’histones24,25. De plus, scCUT&Tag a été optimisé pour le profilage de plusieurs facteurs dans une seule cellule (multiCUT&Tag) et pour une application aux protéines non histones26. Ensemble, CUT&RUN offre une alternative attrayante au ChIP-seq à faible entrée où uliCUT&RUN peut être effectué dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire ayant accès à un trieur de cellules et à un équipement standard.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Déterminer les emplacements de liaison d’une protéine sur la chromatine est essentiel pour comprendre sa fonction et ses cibles régulatrices potentielles. L’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est la référence en matière de détermination de la localisation des protéines depuis plus de 30 ans et se définit par l’utilisation d’un anticorps pour extraire la protéine d’intérêt de la chromatine sonique ou digérée par voie enzymatique. Plus récemment, les techniques d’attache d’anticorps sont devenues populaires pour évaluer la localisation des protéines sur la chromatine en raison de leur sensibilité accrue. Le clivage sous cibles et libération sous nucléase (CUT&RUN) est le dérivé à l’échelle du génome de l’immunocléavage de la chromatine (ChIC) et utilise la protéine A recombinante attachée à la nucléase micrococcique (pA-MNase) pour identifier la région constante IgG de l’anticorps ciblant une protéine d’intérêt, permettant ainsi un clivage spécifique au site de l’ADN flanquant la protéine d’intérêt. CUT&RUN peut être utilisé pour profiler les modifications des histones, les facteurs de transcription et d’autres protéines de liaison à la chromatine telles que les facteurs de remodelage des nucléosomes. Il est important de noter que CUT&RUN peut être utilisé pour évaluer la localisation des protéines associées à l’euchromatique ou à l’hétérochromatique et les modifications des histones. Pour ces raisons, CUT&RUN est une méthode puissante pour déterminer les profils de liaison d’une large gamme de protéines. Récemment, CUT&RUN a été optimisé pour le profilage des facteurs de transcription dans de faibles populations de cellules et de cellules individuelles et le protocole optimisé a été appelé CUT&RUN à entrée ultra-faible (uliCUT&RUN). Ici, un protocole détaillé est présenté pour le profilage de facteur unicellulaire à l’aide d’uliCUT&RUN dans un format manuel de 96 puits.

Ici, un protocole détaillé est présenté pour le profilage de protéines unicellulaires sur la chromatine en utilisant un format manuel de 96 puits uliCUT & RUN. Bien que les résultats varient en fonction de la protéine profilée (en raison de l’abondance des protéines et de la qualité des anticorps), du type de cellule et d’autres facteurs contributifs, les résultats prévus pour cette technique sont discutés ici. La qualité cellulaire (apparence cellulaire et pourcentage de cellules viables) et le tri uni...

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Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN et ses variantes peuvent être utilisés pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine. Ce protocole décrit comment déterminer la localisation des protéines sur la chromatine à l’aide d’uliCUT&RUN unicellulaire.

Localisation du facteur unicellulaire sur la chromatine à l’aide d’un clivage d’entrée ultra-faible sous les cibles et libération à l’aide de la nucléase

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN est une technique puissante pour déterminer la localisation des protéines sur la chromatine, et nous décrivons ici une version unicellulaire de cette technique dans un format manuel à 96 puits. La plupart des techniques de localisation des protéines, comme ChIP-seq, nécessitent un apport cellulaire élevé et prennent environ trois jours. CUT&RUN, en raison du signal élevé et de l’arrière-plan faible, a été optimisé pour les applications à cellules basses et à cellule unique, et peut être complété en une seule journée.Nous envisageons que cette technique peut être appliquée à presque tous les échantillons biologiques et peut être particulièrement puissante pour déterminer la localisation des facteurs dans des échantillons rares et de faible abondance, tels que des échantillons de patients précieux. Avant d’effectuer des expériences sur une seule cellule, testez l’anticorps et la technique sur un grand nombre de cellules non précieuses. La principale limite de cette expérience est la dépendance à un anticorps robuste.Santana Lardo, une spécialiste de recherche expérimentée de mon laboratoire, fait la démonstration de la procédure. Après avoir trié les cellules individuelles et les noyaux de liaison aux billes, placez la plaque de 96 puits sur un rack magnétique de 96 puits et laissez les perles se lier pendant au moins cinq minutes. Ensuite, retirez et jetez le surnageant.Ajouter 100 microlitres de tampon bloquant aux billes liées au noyau, mélanger avec un pipetage doux et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et laissez le surnageant dégager pendant au moins cinq minutes. Ensuite, retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 100 microlitres de tampon de lavage par réaction avec un pipetage doux. Replacez la plaque sur le rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager, puis retirez et jetez le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 25 microlitres de tampon de lavage par réaction avec pipetage doux.Fabriquer un mélange maître d’anticorps primaires en citant 25 microlitres de tampon de lavage par réaction, puis ajouter 0,5 microlitre d’anticorps par réaction. Ajouter 25,5 microlitres du mélange tampon de lavage d’anticorps, suivi d’un pipetage doux à chaque échantillon traité avec un anticorps ciblant la protéine d’intérêt. Incuber pendant une heure à température ambiante.Ensuite, replacez les échantillons sur le rack magnétique à 96 puits. Une fois que le surnageant est clair, retirez-le et jetez-le sans déranger les perles. Après avoir retiré la plaque de la grille magnétique, lavez les billes avec 100 microlitres de tampon de lavage et remettez en suspension par pipetage.Après avoir replacé la plaque sur un rack magnétique de 96 puits et éliminé le surnageant comme démontré précédemment, remettez en suspension chaque échantillon dans 25 microlitres de tampon de lavage. Faire un mélange maître de protéine A MNase en ajoutant 25 microlitres de tampon de lavage et une quantité optimisée de protéine A MNase par réaction. Ajouter 25 microlitres de mélange maître de protéine A MNase à chaque échantillon, y compris les échantillons témoins.Incuber les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits. Laissez le surnageant dégager pendant au moins cinq minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.Après avoir retiré la plaque de la grille magnétique, lavez les billes avec 100 microlitres de tampon de lavage et remettez en suspension par pipetage doux. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et jetez le surnageant comme démontré précédemment. Ensuite, retirez les échantillons du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 50 microlitres de tampon de lavage par pipetage doux.Équilibrez les échantillons à zéro degré Celsius dans un mélange d’eau glacée pendant cinq minutes, puis retirez les échantillons du bain-marie. Ajouter un microlitre de chlorure de calcium de 100 millimolaires à l’aide d’une pipette multicanal. Bien mélanger trois à cinq fois avec un pipetage doux à l’aide d’une pipette multicanal à grand volume, puis remettre les échantillons à zéro degré Celsius.Démarrez une minuterie de 10 minutes dès que la plaque est de retour dans le bain-marie. Arrêter la réaction en pipetant 50 microlitres d’une solution contenant deux fois la concentration de RSTOP+ et tampon dans chaque puits dans le même ordre que le chlorure de calcium a été ajouté. Incuber les échantillons pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.Faites tourner la plaque à 16 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits. Laissez le surnageant s’éclaircir pendant au moins cinq minutes.Ensuite, transférez les surnageants dans une assiette fraîche de 96 puits et jetez les perles. Pour l’extraction de l’ADN, ajoutez un microlitre de 10% de FDS et 0,83 microlitre de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K à chaque échantillon et mélangez les échantillons par pipetage doux. Incuber les échantillons pendant 10 minutes à 70 degrés Celsius.Remettre la plaque à température ambiante. Ajouter 46,6 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et 90 microlitres de PEG4000 à 50 % et mélanger par pipetage doux. Ajouter 33 microlitres de billes de magnétite de polystyrène à chaque échantillon et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez le surnageant dégager pendant environ cinq minutes. Ensuite, jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles. Rincer deux fois avec 150 microlitres d’éthanol à 80% sans déranger les billes.Faites tourner brièvement la plaque à 1000 fois G pendant 30 secondes. Replacez la plaque sur un rack magnétique de 96 puits et retirez tout l’éthanol résiduel sans perturber les billes. Sécher les échantillons à l’air libre pendant environ deux à cinq minutes.Remettre en suspension les billes dans 37,5 microlitres de chlorhydrate TRIS de 10 millimolaires de pH 8 et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Replacez la plaque sur une grille magnétique et laissez les perles se lier pendant cinq minutes. Transférer 36,5 microlitres du surnageant sur une plaque fraîche de 96 puits compatible avec le thermocycleur et jeter les perles.Après avoir effectué une évaluation de la qualité des cellules, l’apparence et le pourcentage des cellules ont été examinés, démontrant que les cellules souches embryonnaires de mauvaise qualité ne devraient pas être utilisées. Le tri unicellulaire a été effectué à l’aide de la coloration Hoechst 33342, et les cellules d’essai ont été comptées pour s’assurer que zéro ou une cellule est trouvée dans chaque puits. L’analyse du gel d’agarose a révélé une échelle de faible poids moléculaire et des bibliothèques individuelles uliCUT&RUN à cellule unique.L’analyse sous-optimale et optimale de la bibliothèque montre une échelle de faible poids moléculaire, une bibliothèque sous-optimale en raison d’une digestion inefficace des mnésons et une bibliothèque réussie avec une digestion appropriée. La distribution de l’analyseur de fragments montre que la taille attendue d’une seule cellule varie de 150 à 500 paires de bases. Cependant, dans les grandes protéines, l’ADN aura environ 270 paires de bases.L’occupation des protéines à l’aide d’un navigateur de génome à un seul locus représentant un nombre élevé de cellules ou un contrôle négatif et d’un CTCF unicellulaire uliCUT & RUN a révélé que la cellule unique représentait en grande partie de forts pics, similaires à uliCUT & RUN à haute cellule. Les cartes thermiques du CTCF unicellulaire ou du contrôle négatif ont révélé un modèle clair d’enrichissement en lecture directement sur les sites de liaison CTCF établis dans les cellules. Les cartes thermiques unidimensionnelles montrent une densité de lecture plus élevée sur les sites de liaison CTCF établis dans les bibliothèques unicellulaires par rapport aux régions environnantes et aux témoins sans anticorps, démontrant un enrichissement spécifique des anticorps aux sites de liaison établis.Il est important d’équilibrer les noyaux liés aux billes sur le bain-marie et de ne pas surchauffer l’échantillon lors de l’ajout de chlorure de calcium pour éviter une digestion excessive de la chromatine.

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