Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern des Hainer Lab für die Lektüre und Kommentare zu einer früheren Version dieses Manuskripts. Dieses Projekt verwendete den NextSeq500, der am Health Sciences Sequencing Core der University of Pittsburgh am UPMC Children's Hospital of Pittsburgh für die Sequenzierung verfügbar ist, mit besonderem Dank an seinen Direktor, William MacDonald. Diese Forschung wurde zum Teil vom University of Pittsburgh Center for Research Computing durch die bereitgestellten Computerressourcen unterstützt. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grant Nummer R35GM133732 (zu S.J.H.) unterstützt.

Ethikerklärung: Alle Studien wurden vom Institutional Biosafety Office of Research Protections an der University of Pittsburgh genehmigt.
1. Bereiten Sie magnetische Perlen vor
HINWEIS: Vor der Zellsortierung durchführen und bis zum Gebrauch auf Eis halten.
<ol><li>Pipette 30 μL ConA-konjugierte paramagnetische Mikrokugeln Perlenschlammmischung pro Reaktion zu einem frischen 1,5 ml Mikrofugenröhrchen und 850 μL Bindungspuffer hinzufügen, vor...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. 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C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN ist ein effektives Protokoll zur Bestimmung der Proteinlokalisation auf Chromatin. Es hat viele Vorteile im Vergleich zu anderen Protokollen, einschließlich: 1) hohes Signal-Rausch-Verhältnis, 2) schnelles Protokoll und 3) niedrige Sequenzierungsleseabdeckung erforderlich, was zu Kosteneinsparungen führt. Die Verwendung von Protein A- oder Protein A/G-MNase ermöglicht die Anwendung von CUT&RUN mit jedem verfügbaren Antikörper; Daher hat es das Potenzial, viele Proteine schnell und einfach zu profilieren. Di...

Viele Kernproteine funktionieren, indem sie mit Chromatin interagieren, um DNA-vorlagenbasierte Aktivitäten zu fördern oder zu verhindern. Um die Funktion dieser Chromatin-interagierenden Proteine zu bestimmen, ist es wichtig, die genomischen Stellen zu identifizieren, an denen diese Proteine gebunden sind. Seit seiner Entwicklung im Jahr 1985 ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) der Goldstandard, um zu identifizieren, wo ein Protein an Chromatin 1,2 bindet. Die traditionelle ChIP-Technik hat den folgenden grundlegenden Arbeitsablauf: Zellen werden geerntet und vernetzt (in der Regel mit Formaldehyd), Chromatin geschoren wird (normalerweise mit harten Ultraschallmethoden, die eine Vernetzung erfordern), das interessierende Protein wird mit einem Antikörper, der auf das Protein abzielt (oder das Protein markiert), gefolgt von einem sekundären Antikörper (gekoppelt an Agarose oder magnetische Perlen) immunpräzipitiert, die Vernetzung wird umgekehrt, Protein und RNA werden verdaut, um DNA zu reinigen, und diese ChIP-angereicherte DNA wird als Vorlage für die Analyse verwendet (unter Verwendung der radioaktiv markierten Sonden1,2, qPCR 3, Microarrays 5,6 oder Sequenzierung4). Mit dem Aufkommen von Microarrays und massiv paralleler Tiefensequenzierung wurden ChIP-Chip 5,6 und ChIP-seq4 in jüngerer Zeit entwickelt und ermöglichen eine genomweite Identifizierung der Proteinlokalisation auf Chromatin. Die Vernetzung von ChIP ist seit seiner Einführung eine leistungsstarke und zuverlässige Technik mit großen Fortschritten in der Auflösung durch ChIP-exo 7 und ChIP-nexus8. Parallel zur Entwicklung von ChIP-seq wurden native (nicht vernetzende) Protokolle für ChIP (N-ChIP) etabliert, die den Nukleaseaufschluss (oft unter Verwendung von Mikrokokkennuklease oder MNase) verwenden, um das Chromatin zu fragmentieren, im Gegensatz zur Beschallung, die in traditionellen Vernetzungs-ChIP-Techniken durchgeführt wird9. Ein großer Nachteil sowohl bei der Vernetzung von ChIP- als auch bei N-ChIP-Technologien war jedoch die Anforderung hoher Zellzahlen aufgrund der geringen DNA-Ausbeute nach der experimentellen Manipulation. Daher wurden in den letzten Jahren viele Anstrengungen unternommen, um die ChIP-Technologien für einen geringen Zelleintrag zu optimieren. Diese Bemühungen haben zur Entwicklung vieler leistungsstarker ChIP-basierter Technologien geführt, die sich in ihrer Anwendbarkeit und ihren Eingabeanforderungen unterscheiden 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Es fehlen jedoch einzellige ChIP-seq-basierte Technologien, insbesondere für Nicht-Histon-Proteine.
Im Jahr 2004 wurde eine alternative Technologie entwickelt, um die Proteinbelegung von Chromatin zu bestimmen, die als Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) und Chromatin Immunocleavage (ChIC)19 bezeichnet wird. Diese Single-Locus-Techniken verwenden eine Fusion von MNase entweder zum interessierenden Protein (ChEC) oder zu Protein A (ChIC) zum direkten Schneiden von DNA neben dem interessierenden Protein. In den letzten Jahren wurden sowohl ChEC als auch ChIC für die genomweite Proteinprofilierung auf Chromatin (ChEC-seq bzw. CUT&RUN) optimiert.20,21. Während ChEC-seq eine leistungsfähige Technik zur Bestimmung der Faktorlokalisierung ist, erfordert es die Entwicklung von MNase-Fusionsproteinen für jedes Ziel, während ChIC und seine genomweite Variation, CUT & RUN, auf einem Antikörper beruhen, der auf das interessierende Protein gerichtet ist (wie bei ChIP) und rekombinanter Protein-A-MNase, wobei das Protein A die IgG-konstante Region des Antikörpers erkennen kann. Als Alternative wurde eine Fusionsprotein-A/Protein-G-MNase (pA/G-MNase) entwickelt, die ein breiteres Spektrum von Antikörperkonstantenregionen erkennen kann22. CUT&RUN hat sich schnell zu einer beliebten Alternative zu ChIP-seq entwickelt, um die Proteinlokalisation auf dem gesamten Chromatin-Genom zu bestimmen.
Ultra-Low-Input CUT&RUN (uliCUT&RUN), eine Variante von CUT&RUN, die die Verwendung von Low- und Single-Cell-Inputs ermöglicht, wurde2019 23 beschrieben. Hier wird die Methodik für eine manuelle Einzelzellenanwendung im 96-Well-Format beschrieben. Es ist wichtig zu beachten, dass seit der Entwicklung von uliCUT&RUN zwei Alternativen für die Histonprofilierung, CUT&Tag und iACT-seq, entwickelt wurden, die eine robuste und hochparallele Profilierung von Histonproteinenermöglichen 24,25. Darüber hinaus wurde scCUT&Tag für die Profilierung mehrerer Faktoren in einer einzelnen Zelle (multiCUT&Tag) und für die Anwendung auf Nicht-Histon-Proteineoptimiert 26. Zusammen bietet CUT&RUN eine attraktive Alternative zu Low-Input-ChIP-seq, bei der uliCUT&RUN in jedem molekularbiologischen Labor durchgeführt werden kann, das Zugang zu einem Zellsortierer und Standardausrüstung hat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Die Bestimmung der Bindungsorte eines Proteins an Chromatin ist für das Verständnis seiner Funktion und potenzieller regulatorischer Ziele unerlässlich. Die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist seit über 30 Jahren der Goldstandard für die Bestimmung der Proteinlokalisation und wird durch die Verwendung eines Antikörpers definiert, um das interessierende Protein aus beschalltem oder enzymatisch verdautem Chromatin herauszuziehen. In jüngster Zeit sind Antikörper-Tethering-Techniken aufgrund ihrer erhöhten Empfindlichkeit zur Beurteilung der Proteinlokalisation auf Chromatin populär geworden. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) ist das genomweite Derivat der Chromatin-Immunspaltung (ChIC) und verwendet rekombinantes Protein A, das an Mikrokokken-Nuklease (pA-MNase) gebunden ist, um die IgG-konstante Region des Antikörpers zu identifizieren, die auf ein Protein von Interesse abzielt, wodurch eine ortsspezifische Spaltung der DNA ermöglicht wird, die das interessierende Protein flankiert. CUT & RUN kann verwendet werden, um Histonmodifikationen, Transkriptionsfaktoren und andere Chromatin-bindende Proteine wie Nukleosomen-Umbaufaktoren zu profilieren. Wichtig ist, dass CUT&RUN verwendet werden kann, um die Lokalisation von entweder neuromatischen oder heterochromatisch assoziierten Proteinen und Histonmodifikationen zu beurteilen. Aus diesen Gründen ist CUT&RUN eine leistungsfähige Methode, um die Bindungsprofile einer Vielzahl von Proteinen zu bestimmen. Vor kurzem wurde CUT&RUN für die Profilierung von Transkriptionsfaktoren in niedrigen Zellpopulationen und Einzelzellen optimiert und das optimierte Protokoll wurde als Ultra-Low Input CUT&RUN (uliCUT&RUN) bezeichnet. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Einzelzellfaktorprofilierung mit uliCUT&RUN in einem manuellen 96-Well-Format vorgestellt.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Einzelzellproteinprofilierung auf Chromatin unter Verwendung eines manuellen 96-Well-Formats uliCUT & RUN vorgestellt. Während die Ergebnisse basierend auf dem Profiling des Proteins (aufgrund der Proteinhäufigkeit und der Antikörperqualität), dem Zelltyp und anderen beitragenden Faktoren variieren, werden die erwarteten Ergebnisse für diese Technik hier diskutiert. Die Zellqualität (Zellaussehen und Prozentsatz der lebensfähigen Zellen) und die Einzelzellsortierung s...

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Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN und seine Varianten können verwendet werden, um die Proteinbelegung auf Chromatin zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Proteinlokalisation auf Chromatin mit Hilfe von einzelligem uliCUT&RUN bestimmt werden kann.

Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT & RUN ist eine leistungsstarke Technik zur Bestimmung der Proteinlokalisation auf Chromatin, und hier beschreiben wir eine Einzelzellversion dieser Technik in einem manuellen 96-Well-Format. Die meisten Proteinlokalisierungstechniken, wie ChIP-seq, erfordern einen hohen Zelleintrag und dauern etwa drei Tage. CUT&RUN wurde aufgrund des hohen Signals und des niedrigen Hintergrunds für Low-Cell- und Single-Cell-Anwendungen optimiert und kann an einem einzigen Tag abgeschlossen werden.Wir stellen uns vor, dass diese Technik auf fast jede biologische Probe angewendet werden kann und besonders leistungsfähig sein kann, um die Faktorlokalisierung in seltenen und niedrig dosierten Proben, wie z. B. wertvollen Patientenproben, zu bestimmen. Bevor Sie Einzelzellexperimente durchführen, testen Sie den Antikörper und die Technik an einer hohen Anzahl von nicht wertvollen Zellen. Die Haupteinschränkung dieses Experiments ist die Abhängigkeit von einem robusten Antikörper.Demonstriert wird das Verfahren von Santana Lardo, einem erfahrenen Forschungsspezialisten aus meinem Labor. Nachdem Sie einzelne Zellen sortiert und Kerne an Perlen gebunden haben, legen Sie die 96-Well-Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und lassen Sie die Perlen mindestens fünf Minuten binden. Entfernen Sie dann den Überstand und verwerfen Sie ihn.Fügen Sie 100 Mikroliter blockierenden Puffer zu den kerngebundenen Perlen hinzu, mischen Sie sie mit sanftem Pipettieren und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen. Entfernen und entsorgen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Perlen in 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Reaktion mit sanftem Pipettieren. Legen Sie die Platte wieder auf das 96-Well-Magnetrack, lassen Sie den Überstand aufräumen, entfernen und verwerfen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie die Perlen in 25 Mikrolitern Waschpuffer pro Reaktion mit sanftem Pipettieren.Machen Sie eine primäre Antikörper-Mastermischung, indem Sie 25 Mikroliter Waschpuffer pro Reaktion aliquotieren und dann 0,5 Mikroliter Antikörper pro Reaktion hinzufügen. Fügen Sie 25,5 Mikroliter der Antikörper-Waschpuffermischung hinzu, gefolgt von einem sanften Pipettieren zu jeder Probe, die mit einem Antikörper behandelt wird, der auf das interessierende Protein abzielt. Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.Legen Sie die Proben dann wieder auf das 96-Well-Magnetrack. Sobald der Überstand klar ist, entfernen und entsorgen Sie ihn, ohne die Perlen zu stören. Nachdem Sie die Platte aus dem Magnetgestell entfernt haben, waschen Sie die Perlen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und suspendieren Sie sie durch Pipettieren.Nachdem Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetrack gelegt und Überstände entsorgt haben, wie zuvor gezeigt, suspendieren Sie jede Probe in 25 Mikroliter Waschpuffer. Machen Sie eine Protein-A-MNase-Mastermischung, indem Sie 25 Mikroliter Waschpuffer und eine optimierte Menge an Protein-A-MNase pro Reaktion hinzufügen. Geben Sie 25 Mikroliter Protein-A-MNase-Mastermischung zu jeder Probe, einschließlich der Kontrollproben.Die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack mit 96 Vertiefungen. Lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen und entfernen und verwerfen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.Nachdem Sie die Platte aus dem Magnetgestell entfernt haben, waschen Sie die Perlen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und suspendieren Sie sie durch sanftes Pipettieren. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und entsorgen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Entfernen Sie dann die Proben aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Perlen in 50 Mikrolitern Waschpuffer durch sanftes Pipettieren.Die Proben in einer Eiswassermischung fünf Minuten lang auf null Grad Celsius ausgleichen und dann aus dem Eiswasserbad entnehmen. Fügen Sie einen Mikroliter 100-millimoläres Calciumchlorid mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Mischen Sie gut drei- bis fünfmal mit sanftem Pipettieren mit einer großvolumigen Mehrkanalpipette und bringen Sie die Proben dann auf null Grad Celsius zurück.Starten Sie einen 10-Minuten-Timer, sobald die Platte wieder im Eiswasserbad ist. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter einer Lösung, die die doppelte Konzentration von RSTOP+ und Puffer enthält, in jede Vertiefung in der gleichen Reihenfolge pipettieren, in der das Calciumchlorid zugegeben wurde. Die Proben 20 Minuten bei 37 Grad Celsius ausbrüten.Drehen Sie die Platte bei 16.000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack mit 96 Vertiefungen. Lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen.Übertragen Sie dann Überstände auf eine frische 96-Well-Platte und werfen Sie die Perlen weg. Für die DNA-Extraktion fügen Sie jeder Probe einen Mikroliter 10% SDS und 0,83 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu und mischen Sie die Proben durch sanftes Pipettieren. Die Proben für 10 Minuten bei 70 Grad Celsius inkubieren.Stellen Sie die Platte auf Raumtemperatur zurück. Fügen Sie 46,6 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid und 90 Mikroliter 50% PEG4000 hinzu und mischen Sie es durch sanftes Pipettieren. Geben Sie 33 Mikroliter Polystyrol-Magnetitperlen zu jeder Probe und inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack und lassen Sie den Überstand etwa fünf Minuten lang aufräumen. Entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören. Zweimal mit 150 Mikrolitern 80% Ethanol abspülen, ohne die Perlen zu stören.Drehen Sie die Platte 30 Sekunden lang kurz bei 1000 mal G. Legen Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetgestell und entfernen Sie das gesamte Restethanol, ohne die Perlen zu stören. Trocknen Sie die Proben etwa zwei bis fünf Minuten an der Luft.Resuspendieren Sie die Perlen in 37,5 Mikrolitern 10-millimolärem TRIS-Hydrochlorid mit pH 8 und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte wieder auf ein magnetisches Gestell und lassen Sie die Perlen fünf Minuten lang binden. Übertragen Sie 36,5 Mikroliter des Überstands auf eine frische, thermocyclerkompatible 96-Well-Platte und entsorgen Sie die Perlen.Nach der Beurteilung der Zellqualität wurden das Aussehen und der Prozentsatz der Zellen untersucht, was zeigte, dass minderwertige embryonale Stammzellen nicht verwendet werden sollten. Die Einzelzellsortierung wurde mit Hoechst 33342-Färbung durchgeführt, und die Testzellen wurden gezählt, um sicherzustellen, dass entweder Null oder eine Zelle in jedem Bohrloch gefunden wird. Die Agarosegel-Analyse ergab eine niedermolekulare Leiter und einzelne einzellige uliCUT&RUN-Bibliotheken.Suboptimale und optimale Bibliotheksanalysen zeigen eine niedermolekulare Leiter, eine suboptimale Bibliothek aufgrund einer ineffizienten Mnase-Verdauung und eine erfolgreiche Bibliothek mit geeigneter Verdauung. Die Verteilung des Fragmentanalysators zeigt, dass die erwartete Größe von Einzelzellen zwischen 150 und 500 Basenpaaren liegt. In großen Proteinen wird die DNA jedoch etwa 270 Basenpaare haben.Die Proteinbelegung unter Verwendung des Single-Locus-Genom-Browsers, der eine hohe Zellzahl oder Negativkontrolle darstellt, und des Einzelzell-CTCF uliCUT&RUN zeigten, dass Einzelzellen weitgehend starke Peaks darstellten, ähnlich wie hochzellige uliCUT&RUN. Heatmaps von Einzelzell-CTCF oder Negativkontrolle zeigten ein klares Muster der Leseanreicherung direkt über etablierten CTCF-Bindungsstellen in den Zellen. Eindimensionale Heatmaps zeigen eine höhere Lesedichte gegenüber etablierten CTCF-Bindungsstellen in Einzelzellbibliotheken im Vergleich zu umgebenden Regionen und No-Antibody-Kontrollen, was eine antikörperspezifische Anreicherung an etablierten Bindungsstellen zeigt.Es ist wichtig, die perlengebundenen Kerne auf dem Eiswasserbad auszugleichen und die Probe bei der Zugabe von Calciumchlorid nicht zu überhitzen, um eine Überverdauung des Chromatins zu verhindern.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Forschung

Biologie

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...