Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדת היינר על הקריאה וההערות על גרסה מוקדמת יותר של כתב יד זה. פרויקט זה השתמש NextSeq500 זמין באוניברסיטת פיטסבורג מדעי הבריאות רצף הליבה בבית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג עבור ריצוף עם תודה מיוחדת למנהל שלה, ויליאם מקדונלד. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מרכז אוניברסיטת פיטסבורג למחשוב מחקר באמצעות משאבי המחשב שסופקו. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק מספר R35GM133732 (כדי S.J.H.).

הצהרת אתיקה: כל המחקרים אושרו על ידי המשרד המוסדי להגנה על בטיחות ביולוגית באוניברסיטת פיטסבורג.
1. הכינו חרוזים מגנטיים
הערה: יש לבצע לפני מיון התאים ולהחזיק בקרח עד לשימוש.
<ol><li>פיפטה 30 μL של מיקרוספרות פרמגנטיות מצומדות ConA תערובת חריזה לכל תגובה ל?...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN הוא פרוטוקול יעיל לקביעת לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. יש לו יתרונות רבים ביחס לפרוטוקולים אחרים, כולל: 1) יחס אות לרעש גבוה, 2) פרוטוקול מהיר, ו-3) כיסוי קריאה ברצף נמוך הנדרש ובכך מוביל לחיסכון בעלויות. השימוש בחלבון A- או חלבון A/G-MNase מאפשר להחיל את CUT&RUN עם כל נוגדן זמין; לכן, יש לו את הפוט?...

חלבונים גרעיניים רבים פועלים על ידי אינטראקציה עם כרומטין כדי לקדם או למנוע פעילויות בתבנית DNA. כדי לקבוע את הפונקציה של חלבונים אלה כרומטין אינטראקציה, חשוב לזהות את המיקומים הגנומיים שבהם חלבונים אלה קשורים. מאז התפתחותו בשנת 1985, אימונופרציפציה כרומטין (ChIP) היה תקן הזהב לזיהוי היכן חלבון נקשר לכרומטין 1,2. לטכניקת ChIP המסורתית יש את זרימת העבודה הבסיסית הבאה: תאים נקצרים ומקושרים (בדרך כלל עם פורמלדהיד), כרומטין הוא גזירה (בדרך כלל עם שיטות sonication קשות, המחייבות crosslinking), החלבון של עניין הוא immunoprecipitated באמצעות נוגדן המכוון החלבון (או חלבון מתויג) ואחריו נוגדן משני (בשילוב אגרוזים או חרוזים מגנטיים), crosslinking הוא הפוך, חלבון ורנ"א מתעכלים כדי לטהר DNA, ו- CHIP מועשר-DNA זה משמש כתבנית לניתוח (באמצעות בדיקות עם תווית רדיו 1,2, qPCR3, מיקרו-אריות 5,6, או רצף4). עם הופעתם של מיקרו-ערים ורצף עמוק מקביל מאסיבי, צ'יפ-צ'יפ-צ'יפ 5,6 ו-ChIP-seq4 פותחו לאחרונה ומאפשרים זיהוי כללי של לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. Crosslinking ChIP הייתה טכניקה רבת עוצמה ואמינה מאז הופעתה עם התקדמות משמעותית ברזולוציה על ידי ChIP-exo7 ו ChIP-נקסוס8. במקביל להתפתחות של ChIP-seq, פרוטוקולים מקוריים (ללא crosslinking) עבור ChIP (N-ChIP) הוקמו, אשר משתמשים בעיכול נוקלאז (לעתים קרובות באמצעות נוקלאז מיקרוקוקאלי או MNase) כדי לפצל את הכרומטין, בניגוד sonication המבוצע בטכניקות ChIP crosslinking מסורתיות9. עם זאת, חיסרון מרכזי אחד הן בהצלבה של טכנולוגיות ChIP והן בטכנולוגיות N-ChIP היה הדרישה למספרי תאים גבוהים עקב תפוקת דנ"א נמוכה בעקבות המניפולציה הניסיונית. לכן, בשנים האחרונות, מאמצים רבים היו לקראת אופטימיזציה של טכנולוגיות ChIP עבור קלט תא נמוך. מאמצים אלה הביאו לפיתוח טכנולוגיות רבות עוצמה המבוססות על ChIP המשתנות בדרישות הישימות והקלט שלהן 10,11,12,13,14,15,16,17,18. עם זאת, טכנולוגיות מבוססות ChIP-seq חד-תאיות חסרות, במיוחד עבור חלבונים שאינם histone.
בשנת 2004 פותחה טכנולוגיה חלופית כדי לקבוע את תפוסת החלבון על כרומטין המכונה מחשוף כרומטין אנדוגני (ChEC) ו כרומטין Immunocleavage (ChIC)19. טכניקות לוקוס בודדות אלה משתמשות בהיתוך של MNase לחלבון העניין (ChEC) או לחלבון A (ChIC) לחיתוך ישיר של DNA הסמוך לחלבון העניין. בשנים האחרונות, הן ChEC והן ChIC עברו אופטימיזציה ליצירת פרופיל חלבון רחב גנום על כרומטין (ChEC-seq ו- CUT&RUN, בהתאמה)20,21. בעוד ChEC-seq היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת לוקליזציה של גורמים, היא דורשת פיתוח חלבוני MNase-היתוך עבור כל מטרה, ואילו ChIC והווריאציה הרחבה של הגנום שלה, CUT&RUN, מסתמכים על נוגדן המכוון לחלבון העניין (כמו עם ChIP) וחלבון רקומביננטי A-MNase, שבו חלבון A יכול לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן. כחלופה, פותח חלבון היתוך A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) שיכול לזהות מגוון רחב יותר של אזורים קבועים נוגדנים22. CUT&RUN הפכה במהירות לחלופה פופולרית ל-ChIP-seq לקביעת לוקליזציה של חלבונים בגנום כרומטין בכל רחבי.
CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN), וריאציה של CUT&RUN המאפשרת שימוש בכניסות נמוכות ותא בודד, תוארה בשנת 201923. כאן מתוארת המתודולוגיה עבור יישום ידני של תא יחיד בתבנית 96 well. חשוב לציין כי מאז הפיתוח של uliCUT&RUN, פותחו שתי חלופות ליצירת פרופיל histone, CUT&Tag ו- iACT-seq, המספקות פרופיל חזק ומקביל מאוד של חלבוני הייסטון24,25. יתר על כן, scCUT&Tag עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמים מרובים בתא יחיד (multiCUT&Tag) וליישום חלבונים שאינם histone26. יחד, CUT&RUN מספקת חלופה אטרקטיבית ל- ChIP-seq עם קלט נמוך שבו ניתן לבצע uliCUT&RUN בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית שיש לה גישה לממיין תאים וציוד סטנדרטי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

קביעת המיקומים המחייבים של חלבון על כרומטין חיונית להבנת תפקידו ויעדיו הרגולטוריים הפוטנציאליים. כרומטין אימונופרציפיטציה (ChIP) היה תקן הזהב לקביעת לוקליזציה של חלבון במשך למעלה מ -30 שנה ומוגדר על ידי שימוש בנוגדן כדי לשלוף את חלבון העניין מכרומטין sonicated או מתעכל אנזימטית. לאחרונה, טכניקות קשירת נוגדנים הפכו פופולריות להערכת לוקליזציה של חלבון על כרומטין בשל הרגישות המוגברת שלהם. מחשוף תחת מטרות & שחרור תחת נוקלאז (CUT&RUN) הוא נגזרת רחבת הגנום של Immunocleavage כרומטין (ChIC) ומשתמש חלבון רקומביננטי A קשור לנוקלאז מיקרוקוקאלי (pA-MNase) כדי לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן מיקוד חלבון של עניין, ובכך מאפשר מחשוף ספציפי לאתר של ה- DNA מאגף את החלבון של עניין. ניתן להשתמש ב- CUT&RUN כדי ליצור פרופיל לשינויים בהיסטון, גורמי שעתוק וחלבונים מחייבי כרומטין אחרים כגון גורמי שיפוץ נוקלאוזום. חשוב לציין, CUT&RUN יכול לשמש כדי להעריך את הלוקליזציה של חלבונים הקשורים euchromatic או הטרוכרומטיים ושינויים histone. מסיבות אלה, CUT&RUN היא שיטה רבת עוצמה לקביעת פרופילי האיגוד של מגוון רחב של חלבונים. לאחרונה, CUT&RUN עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמי שעתוק באוכלוסיות נמוכות של תאים ותאים בודדים והפרוטוקול הממוטב נקרא CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN). כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל גורם תא יחיד באמצעות uliCUT&RUN בתבנית ידנית 96-well.

כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל חלבון תא יחיד על כרומטין באמצעות 96-well בפורמט ידני uliCUT&RUN. בעוד התוצאות ישתנו בהתאם לפרופיל החלבון (בשל שפע חלבון ואיכות נוגדנים), סוג התא, וגורמים תורמים אחרים, התוצאות הצפויות עבור טכניקה זו נדונות כאן. יש להעריך את איכות התא (מראה התא ואחוז התאים הקיימים...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&RUN של תא יחיד.

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת לוקליזציה של חלבונים בכרומטין, וכאן אנו מתארים גרסה חד-תאית של טכניקה זו בפורמט ידני של 96 בארות. רוב טכניקות הלוקליזציה של חלבונים, כמו ChIP-seq, דורשות קלט תא גבוה ולוקח כשלושה ימים להשלים. CUT&RUN, עקב האות הגבוה והרקע הנמוך, עברה אופטימיזציה ליישום של תאים נמוכים ותא יחיד, וניתן להשלים אותה ביום אחד.אנו מדמיינים כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כמעט על כל מדגם ביולוגי והוא יכול להיות חזק במיוחד כדי לקבוע לוקליזציה גורם בדגימות נדירות ושפע נמוך, כגון דגימות חולים יקרות. לפני ביצוע ניסויים בתא יחיד, בדוק את הנוגדן והטכניקה על מספר גבוה של תאים שאינם יקרים. המגבלה העיקרית של ניסוי זה היא התלות בנוגדן חזק.מדגימה את ההליך היא סנטנה לארדו, מומחית מחקר מנוסה מהמעבדה שלי. לאחר מיון תאים בודדים וגרעינים מחייבים לחרוזים, הנח את הלוח בן 96 הבאר על מתלה מגנטי של 96 בארות ואפשר לחרוזים להיקשר למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, להסיר ולהשליך את supernatant.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חוצץ חסימה לחרוזים הקשורים לגרעין, ערבבו עם צינורות עדינים ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well ולאפשר supernatant לנקות לפחות של חמש דקות. לאחר מכן, להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 100 microliters של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים. מניחים את הצלחת בחזרה על המתלה המגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant. הקדישו מחדש את החרוזים ל-25 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל תגובה עם צינורות עדינים.צור תערובת ראשית של אמן נוגדנים על-ידי ציטוט 25 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל תגובה ולאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטרים של נוגדנים לכל תגובה. הוסיפו 25.5 מיקרוליטרים של תערובת מאגר שטיפת הנוגדנים, ולאחר מכן צינורות עדינים לכל דגימה המטופלת בנוגדן המכוון לחלבון העניין. דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שוב למקם את הדגימות בחזרה על מתלה מגנטי 96-well. ברגע supernatant הוא ברור, להסיר ולהשליך אותו מבלי להפריע חרוזים. לאחר הסרת הצלחת מן המתלה המגנטי, לשטוף את החרוזים עם 100 microliters של חוצץ לשטוף resuspend על ידי צינורות.לאחר הנחת הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well ולהשליך supernatant כפי שהוכח בעבר, resuspened כל מדגם ב 25 מיקרוליטרים של חוצץ לשטוף. הפוך חלבון תערובת מאסטר MNase על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של מאגר לשטוף כמות אופטימלית של חלבון A MNase לכל תגובה. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של חלבון תערובת ראשית של MNase לכל דגימה, כולל דגימות הבקרה.לדגור על הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי של 96 בארות. אפשר supernatant לנקות לפחות חמש דקות ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.לאחר הסרת הצלחת מן המתלה המגנטי, לשטוף את החרוזים עם 100 microliters של חוצץ לשטוף מחדש על ידי צינורות עדינים. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96 היטב ולהשליך את supernatant כפי שהוכח בעבר. לאחר מכן, להסיר את הדגימות מן המתלה המגנטי ואת resuspend החרוזים ב 50 מיקרוליטרים של חיץ לשטוף על ידי צינורות עדינים.שיווי משקל את הדגימות לאפס מעלות צלזיוס בתערובת מי קרח במשך חמש דקות ולאחר מכן להסיר את הדגימות מאמבט מי הקרח. הוסיפו מיקרוליטר אחד של סידן כלורי 100 מ"מ באמצעות פיפטה רב-ערוצית. מערבבים היטב שלוש עד חמש פעמים עם צינורות עדינים באמצעות פיפטה רב ערוצית בנפח גדול ולאחר מכן להחזיר את הדגימות לאפס מעלות צלזיוס.התחל טיימר של 10 דקות ברגע שהצלחת חוזרת לאמבטיית מי הקרח. עצור את התגובה על ידי צנרת 50 מיקרוליטרים של פתרון המכיל ריכוז כפול של RSTOP + ולחוצץ לתוך כל באר באותו סדר כמו סידן כלורי נוספה. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לסובב את הצלחת ב 16, 000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי של 96 בארות. תן לסופר-נרטיב להתפנות לחמש דקות לפחות.לאחר מכן, להעביר supernatants לצלחת 96-well טרי ולהשליך את החרוזים. להפקת דנ"א, הוסיפו מיקרוליטר אחד של 10% SDS ו-0.83 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K לכל דגימה וערבבו את הדגימות על ידי צנרת עדינה. לדגור על הדגימות במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס.מחזירים את הצלחת לטמפרטורת החדר. הוסיפו 46.6 מיקרוליטרים של נתרן כלורי בעל חמישה טוחנים ו-90 מיקרוליטרים של 50%PEG4000 וערבבו באמצעות צינורות עדינים. הוסיפו 33 מיקרוליטרים של חרוזי מגנטיט פוליסטירן לכל דגימה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומניחים לסופר-נרטיב להתפנות למשך כחמש דקות. לאחר מכן, בזהירות להשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים. יש לשטוף פעמיים עם 150 מיקרוליטרים של 80% אתנול מבלי להפריע לחרוזים.לסובב את הצלחת לזמן קצר ב 1000 פעמים G במשך 30 שניות. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well ולהסיר את כל האתנול שיורית מבלי להפריע לחרוזים. אוויר לייבש את הדגימות במשך כשתיים עד חמש דקות.לפנק מחדש את החרוזים ב 37.5 microliters של 10 מילימולרי TRIS הידרוכלוריד של pH 8 ודגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להיקשר במשך חמש דקות. העבירו 36.5 מיקרוליטרים של הסופר-נרטיב ללוחית 96 בארות תואמת תרמוציקלר טרייה והשליכו את החרוזים.לאחר ביצוע הערכת איכות התא, נבדקו מראה התא ואחוז, המוכיחים כי אין להשתמש בתאי גזע עובריים באיכות נמוכה. מיון של תאים בודדים בוצע באמצעות כתם Hoechst 33342, ותאי הבדיקה נספרו כדי להבטיח שאפס או תא אחד נמצא בכל באר. ניתוח ג'ל Agarose גילה סולם משקל מולקולרי נמוך וספריות uliCUT&RUN חד-תאיות בודדות.ניתוח הספרייה התת-אופטימלי והאופטימלי מראה סולם במשקל מולקולרי נמוך, ספרייה תת-אופטימלית עקב עיכול Mnase לא יעיל, וספרייה מוצלחת עם עיכול מתאים. התפלגות מנתח הקטעים מראה שהגודל הצפוי של תא בודד נע בין 150 ל- 500 זוגות בסיסים. עם זאת, בחלבונים גדולים, DNA יהיה סביב 270 זוגות בסיס.תפוסת חלבונים באמצעות דפדפן גנום לוקוס יחיד המתאר מספר תא גבוה או שליטה שלילית ו- CTCF uliCUT&RUN חד-תאי חשף כי תא יחיד ייצג במידה רבה פסגות חזקות, בדומה ל- uliCUT&RUN של תאים גבוהים. מפות חום של CTCF חד-תאי או שליטה שלילית חשפו דפוס ברור של העשרת קריאה ישירות מעל אתרי איגוד CTCF מבוססים בתאים. מפות חום חד-ממדיות מראות צפיפות קריאה גבוהה יותר על פני אתרי איגוד CTCF מבוססים בספריות חד-תאיות ביחס לאזורים הסמוכים ובקרות ללא נוגדנים, ומדגימות העשרה ספציפית לנוגדנים באתרי איגוד מבוססים.חשוב לאזן את הגרעינים הקשורים לחרוזים באמבט מי הקרח ולא לחמם יתר על המידה את הדגימה על תוספת סידן כלוריד כדי למנוע עיכול יתר של הכרומטין.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...