Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

हम इस पांडुलिपि के पिछले संस्करण पर पढ़ने और टिप्पणियों के लिए हैनर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस परियोजना ने अपने निदेशक विलियम मैकडॉनल्ड्स के लिए विशेष धन्यवाद के साथ अनुक्रमण के लिए पिट्सबर्ग के यूपीएमसी बच्चों के अस्पताल में पिट्सबर्ग के यूपीएमसी बच्चों के अस्पताल में पिट्सबर्ग स्वास्थ्य विज्ञान अनुक्रमण कोर विश्वविद्यालय में उपलब्ध NextSeq500 का उपयोग किया। इस शोध को प्रदान किए गए कंप्यूटर संसाधनों के माध्यम से पिट्सबर्ग सेंटर फॉर रिसर्च कंप्यूटिंग विश्वविद्यालय द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संख्या R35GM133732 (S.J.H. के लिए) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था।

नैतिकता कथन: सभी अध्ययनों को पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में अनुसंधान संरक्षण के संस्थागत जैव सुरक्षा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. चुंबकीय मोतियों तैयार
नोट: सेल स?...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. 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S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. 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C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN क्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी प्रोटोकॉल है। इसके अन्य प्रोटोकॉल के सापेक्ष कई फायदे हैं, जिनमें शामिल हैं: 1) उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात, 2) तेजी से प्रोटोकॉल, और 3) कम ?...

कई परमाणु प्रोटीन डीएनए-टेम्पलेट गतिविधियों को बढ़ावा देने या रोकने के लिए क्रोमैटिन के साथ बातचीत करके कार्य करते हैं। इन क्रोमैटिन-इंटरैक्टिंग प्रोटीन के कार्य को निर्धारित करने के लिए, उन जीनोमिक स्थानों की पहचान करना महत्वपूर्ण है जिन पर ये प्रोटीन बाध्य हैं। 1985 में इसके विकास के बाद से, क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिसिपेशन (CHIP) यह पहचानने के लिए सोने का मानक रहा है कि एक प्रोटीन क्रोमैटिन 1,2 से कहां बांधता है। पारंपरिक CHIP तकनीक में निम्नलिखित बुनियादी वर्कफ़्लो होता है: कोशिकाओं को काटा जाता है और क्रॉसलिंक किया जाता है (आमतौर पर फॉर्मेल्डिहाइड के साथ), क्रोमैटिन को कतरनी की जाती है (आमतौर पर कठोर sonication विधियों के साथ, क्रॉसलिंकिंग की आवश्यकता होती है), ब्याज के प्रोटीन को एक एंटीबॉडी का उपयोग करके immunoprecipitated किया जाता है जो प्रोटीन (या टैग किए गए प्रोटीन) को लक्षित करता है, इसके बाद एक माध्यमिक एंटीबॉडी (agarose या चुंबकीय मोतियों के लिए युग्मित), क्रॉसलिंकिंग को उलट दिया जाता है, प्रोटीन और आरएनए को डीएनए को शुद्ध करने के लिए पचाया जाता है, और इस CHIP समृद्ध-डीएनए का उपयोग विश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाता है (रेडियोलेबल जांच 1,2, qPCR3, माइक्रोएरे 5,6, या अनुक्रमण4 का उपयोग करके)। माइक्रोएरे और बड़े पैमाने पर समानांतर गहरी अनुक्रमण के आगमन के साथ, CHIP-चिप 5,6 और CHIP-seq4 को हाल ही में विकसित किया गया है और क्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण की जीनोम-व्यापी पहचान के लिए अनुमति देता है। क्रॉसलिंकिंग CHIP CHIP-exo7 और CHIP-Nexus8 द्वारा संकल्प में प्रमुख प्रगति के साथ अपने आगमन के बाद से एक शक्तिशाली और विश्वसनीय तकनीक रही है। CHIP-seq के विकास के समानांतर, CHIP (N-CHIP) के लिए देशी (गैर-क्रॉसलिंकिंग) प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं, जो क्रोमैटिन को खंडित करने के लिए न्यूक्लिएज पाचन (अक्सर माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज या MNase का उपयोग करके) का उपयोग करते हैं, जैसा कि पारंपरिक क्रॉसलिंकिंग CHIP तकनीकों में किए गए sonication के विपरीतहै। हालांकि, क्रॉसलिंकिंग CHIP और N-CHIP प्रौद्योगिकियों दोनों के लिए एक प्रमुख खामी प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद कम डीएनए उपज के कारण उच्च सेल संख्या की आवश्यकता रही है। इसलिए, हाल के वर्षों में, कम सेल इनपुट के लिए CHIP प्रौद्योगिकियों को अनुकूलित करने की दिशा में कई प्रयास किए गए हैं। इन प्रयासों के परिणामस्वरूप कई शक्तिशाली CHIP-आधारित प्रौद्योगिकियों का विकास हुआ है जो उनकी प्रयोज्यता और इनपुट आवश्यकताओं में भिन्न होते हैं 10,11,12,13,14,15,16,17,18। हालांकि, एकल-सेल CHIP-seq आधारित प्रौद्योगिकियों की कमी रही है, विशेष रूप से गैर-हिस्टोन प्रोटीन के लिए।
2004 में, क्रोमैटिन पर प्रोटीन अधिभोग निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक तकनीक विकसित की गई थी जिसे क्रोमैटिन अंतर्जात दरार (सीएचईसी) और क्रोमैटिन इम्युनोक्लीवेज (सीएचआईसी) 19 कहा जाता है। ये एकल-लोकस तकनीकें ब्याज के प्रोटीन से सटे डीएनए के सीधे काटने के लिए या तो ब्याज के प्रोटीन (सीएचईसी) या प्रोटीन ए (जीएचआईसी) के लिए एमएनेस के संलयन का उपयोग करती हैं। हाल के वर्षों में, सीएचईसी और एचआईसी दोनों को क्रोमैटिन पर जीनोम-वाइड प्रोटीन प्रोफाइलिंग के लिए अनुकूलित किया गया है (CHEC-seq और CUT & RUN, क्रमशः) 20,21। जबकि CHEC-seq कारक स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, इसे प्रत्येक लक्ष्य के लिए MNase-fusion प्रोटीन विकसित करने की आवश्यकता होती है, जबकि CHIC और इसके जीनोम-वाइड भिन्नता, CUT & RUN, ब्याज के प्रोटीन की ओर निर्देशित एंटीबॉडी पर भरोसा करते हैं (CHIP के साथ) और पुनः संयोजक प्रोटीन A-MNase, जहां प्रोटीन ए एंटीबॉडी के आईजीजी स्थिर क्षेत्र को पहचान सकता है। एक विकल्प के रूप में, एक संलयन प्रोटीन ए / प्रोटीन जी-एमएनेज (पीए / जी-एमएनेज) विकसित किया गया है जो एंटीबॉडी निरंतर क्षेत्रों की एक व्यापक श्रृंखला को पहचान सकताहै। CUT&RUN तेजी से क्रोमैटिन जीनोम-वाइड पर प्रोटीन स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए CHIP-seq के लिए एक लोकप्रिय विकल्प बन गया है।
अल्ट्रा-लो इनपुट CUT&RUN (uliCUT&RUN), CUT&RUN की एक भिन्नता है जो कम और एकल-सेल इनपुट के उपयोग को सक्षम बनाती है, 201923 में वर्णित की गई थी। यहां, मैन्युअल 96-वेल फॉर्मेट सिंगल-सेल एप्लिकेशन के लिए पद्धति का वर्णन किया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि uliCUT & RUN के विकास के बाद से, हिस्टोन प्रोफाइलिंग, CUT & Tag और iACT-seq के लिए दो विकल्प विकसित किए गए हैं, जो हिस्टोन प्रोटीन24,25 की मजबूत और अत्यधिक समानांतर प्रोफाइलिंग प्रदान करते हैं। इसके अलावा, scCUT &Tag को एक ही सेल (multiCUT & Tag) में कई कारकों को प्रोफाइल करने और गैर-हिस्टोन प्रोटीन26 के लिए आवेदन के लिए अनुकूलित किया गया है। साथ में, CUT&RUN कम इनपुट CHIP-seq के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है जहां uliCUT & RUN को किसी भी आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में किया जा सकता है जिसमें सेल सॉर्टर और मानक उपकरण तक पहुंच है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

क्रोमैटिन पर एक प्रोटीन के बाध्यकारी स्थानों का निर्धारण इसके कार्य और संभावित नियामक लक्ष्यों को समझने के लिए आवश्यक है। क्रोमैटिन इम्युनोप्रिसिपिटेशन (CHIP) 30 से अधिक वर्षों के लिए प्रोटीन स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए सोने का मानक रहा है और इसे सोनिकेटेड या एंजाइमेटिक रूप से पचे हुए क्रोमैटिन से ब्याज के प्रोटीन को बाहर निकालने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग से परिभाषित किया गया है। हाल ही में, एंटीबॉडी टेदरिंग तकनीकक्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए लोकप्रिय हो गई है क्योंकि उनकी बढ़ी हुई संवेदनशीलता के कारण। क्लीवेज अंडर टारगेट एंड रिलीज अंडर न्यूक्लिएज (CUT&RUN) क्रोमैटिन इम्युनोक्लेवेज (CHIC) का जीनोम-वाइड व्युत्पन्न है और पुनः संयोजक प्रोटीन A का उपयोग करता है जो माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज (पीए-MNase) से जुड़ा होता है ताकि एंटीबॉडी के आईजीजी स्थिर क्षेत्र की पहचान की जा सके, जो ब्याज के प्रोटीन को लक्षित करता है, इसलिए ब्याज के प्रोटीन को फ्लैंक करने वाले डीएनए की साइट-विशिष्ट दरार को सक्षम करता है। CUT &RUN का उपयोग हिस्टोन संशोधनों, प्रतिलेखन कारकों और अन्य क्रोमैटिन-बाइंडिंग प्रोटीन जैसे न्यूक्लियोसोम रीमॉडलिंग कारकों को प्रोफ़ाइल करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, CUT &RUN का उपयोग या तो यूक्रोमैटिक- या हेटरोक्रोमैटिक-संबद्ध प्रोटीन और हिस्टोन संशोधनों के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इन कारणों से, CUT &RUN प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के बाध्यकारी प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। हाल ही में, CUT&RUN को कोशिकाओं और एकल कोशिकाओं की कम आबादी में प्रतिलेखन कारक प्रोफाइलिंग के लिए अनुकूलित किया गया है और अनुकूलित प्रोटोकॉल को अल्ट्रा-लो इनपुट CUT&RUN (uliCUT &RUN) कहा जाता है। यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक मैनुअल 96-वेल प्रारूप में यूलिकट एंड रन का उपयोग करके एकल-सेल कारक प्रोफाइलिंग के लिए प्रस्तुत किया गया है।

यहां, क्रोमैटिन पर एकल-सेल प्रोटीन प्रोफाइलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जिसमें 96-अच्छी तरह से मैनुअल प्रारूप यूलिकट एंड रन का उपयोग किया गया है। जबकि परिणाम प्रोटीन प्रोफाइल क?...

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Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN और इसके वेरिएंट का उपयोग क्रोमैटिन पर प्रोटीन अधिभोग निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि एकल-सेल यूलिकट एंड रन का उपयोग करके क्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण कैसे निर्धारित किया जाए।

क्रोमैटिन पर एकल-सेल फैक्टर स्थानीयकरण लक्ष्य के तहत अल्ट्रा-लो इनपुट क्लीवेज का उपयोग करके और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज करें

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT &RUN क्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, और यहां हम एक मैनुअल 96-वेल प्रारूप में इस तकनीक के एकल-सेल संस्करण का वर्णन करते हैं। अधिकांश प्रोटीन स्थानीयकरण तकनीकों, जैसे CHIP-seq, को उच्च सेल इनपुट की आवश्यकता होती है और इसे पूरा करने में लगभग तीन दिन लगते हैं। CUT&RUN, उच्च सिग्नल और कम पृष्ठभूमि के कारण, कम सेल और एकल-सेल एप्लिकेशन के लिए अनुकूलित किया गया है, और इसे एक ही दिन में पूरा किया जा सकता है।हम कल्पना करते हैं कि इस तकनीक को लगभग किसी भी जैविक नमूने पर लागू किया जा सकता है और दुर्लभ और कम-बहुतायत वाले नमूनों में कारक स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए विशेष रूप से शक्तिशाली हो सकता है, जैसे कि कीमती रोगी के नमूने। किसी भी एकल-सेल प्रयोगों को करने से पहले, गैर-कीमती कोशिकाओं की एक उच्च संख्या पर एंटीबॉडी और तकनीक का परीक्षण करें। इस प्रयोग की मुख्य सीमा एक मजबूत एंटीबॉडी पर निर्भरता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन Santana Lardo, मेरी प्रयोगशाला से एक अनुभवी अनुसंधान विशेषज्ञ है. एकल कोशिकाओं और मोतियों के लिए बाध्यकारी नाभिक को छाँटने के बाद, 96-अच्छी तरह से प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें और मोतियों को कम से कम पांच मिनट के लिए बांधने की अनुमति दें। उसके बाद, निकालें और supernatant छोड़ दें।नाभिक-बाध्य मोतियों के लिए बफर को अवरुद्ध करने के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, कोमल पिपेटिंग के साथ मिश्रण करें, और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें और supernatant को कम से कम पांच मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें। फिर, निकालें और मोतियों को परेशान किए बिना supernatant त्याग.चुंबकीय रैक से प्लेट निकालें और कोमल pipetting के साथ प्रतिक्रिया प्रति प्रतिक्रिया धोने बफर के 100 microliters में मोतियों resuspend. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर वापस रखें, supernatant को साफ करने की अनुमति दें, और फिर supernatant को हटा दें और छोड़ दें। कोमल पिपेटिंग के साथ प्रतिक्रिया प्रति वॉश बफर के 25 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया।प्रति प्रतिक्रिया धोने बफर के 25 माइक्रोलीटर को एलीकोट करके एक प्राथमिक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण बनाएं और फिर प्रति प्रतिक्रिया एंटीबॉडी के 0.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। एंटीबॉडी वॉश बफर मिश्रण के 25.5 माइक्रोलीटर जोड़ें, इसके बाद ब्याज के प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी के साथ इलाज किए जा रहे प्रत्येक नमूने के लिए कोमल पिपेटिंग के बाद। कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।फिर, फिर से नमूनों को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर वापस रखें। एक बार supernatant स्पष्ट है, निकालें और परेशान मोतियों के बिना इसे छोड़ दें। चुंबकीय रैक से प्लेट को हटाने के बाद, मोतियों को 100 माइक्रोलीटर वॉश बफर के साथ धोएं और पिपेटिंग द्वारा फिर से निलंबित करें।प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर वापस रखने और supernatant को त्यागने के बाद जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था, प्रत्येक नमूने को धोने के बफर के 25 माइक्रोलीटर में फिर से निलंबित कर दिया। धोने के बफर के 25 माइक्रोलीटर और प्रति प्रतिक्रिया प्रोटीन ए MNase की एक अनुकूलित मात्रा जोड़कर एक प्रोटीन ए MNase मास्टर मिश्रण बनाओ। नियंत्रण नमूनों सहित प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन ए MNase मास्टर मिश्रण के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें।कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें। प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें। supernatant को कम से कम पांच मिनट के लिए साफ़ करने की अनुमति दें और फिर मोतियों को परेशान किए बिना supernatant को हटा दें और छोड़ दें।चुंबकीय रैक से प्लेट को हटाने के बाद, 100 माइक्रोलीटर धोने के बफर के साथ मोतियों को धोएं और कोमल पिपेटिंग द्वारा फिर से निलंबित करें। प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें और पहले प्रदर्शित supernatant को त्याग दें। फिर, चुंबकीय रैक से नमूनों को हटा दें और कोमल पिपेटिंग द्वारा वॉश बफर के 50 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करें।पांच मिनट के लिए एक बर्फ के पानी के मिश्रण में नमूनों को शून्य डिग्री सेल्सियस तक संतुलित करें और फिर बर्फ के पानी के स्नान से नमूनों को हटा दें। एक multichannel पिपेट का उपयोग कर 100-millimolar कैल्शियम क्लोराइड का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। एक बड़ी मात्रा multichannel पिपेट का उपयोग कर कोमल pipetting के साथ अच्छी तरह से तीन से पांच बार मिश्रण और फिर शून्य डिग्री सेल्सियस करने के लिए नमूनों को वापस।जैसे ही प्लेट बर्फ के पानी के स्नान में वापस आ जाती है, 10 मिनट का टाइमर शुरू करें। एक समाधान के 50 माइक्रोलीटर को पिपेट करके प्रतिक्रिया को रोकें जिसमें दो बार आरएसटीओपी + और बफर की एकाग्रता होती है, जिसमें कैल्शियम क्लोराइड के समान क्रम में प्रत्येक कुएं में बफर होता है। नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।प्लेट को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 16, 000 बार जी पर स्पिन करें। प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें। supernatant को कम से कम पांच मिनट के लिए साफ़ करने की अनुमति दें।फिर, एक ताजा 96-अच्छी तरह से प्लेट में supernatants हस्तांतरण और मोतियों को त्याग दें। डीएनए निष्कर्षण के लिए, प्रत्येक नमूने में 10% एसडीएस का एक माइक्रोलीटर और 20 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर प्रोटीनेज के 0.83 माइक्रोलीटर माइक्रोलीटर जोड़ें और कोमल पिपेटिंग द्वारा नमूनों को मिलाएं। 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।प्लेट को कमरे के तापमान पर वापस कर दें। पांच-दाढ़ सोडियम क्लोराइड के 46.6 माइक्रोलीटर और 50% PEG4000 के 90 माइक्रोलीटर जोड़ें और कोमल पिपेटिंग द्वारा मिश्रण करें। प्रत्येक नमूने के लिए polystyrene मैग्नेटाइट मोतियों के 33 microliters जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।प्लेट को चुंबकीय रैक पर रखें और supernatant को लगभग पांच मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें। फिर, ध्यान से मोतियों को परेशान किए बिना supernatant त्याग. मोतियों को परेशान किए बिना 80% इथेनॉल के 150 माइक्रोलीटर के साथ दो बार कुल्ला करें।प्लेट को 30 सेकंड के लिए 1000 बार जी पर संक्षेप में स्पिन करें। प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर वापस रखें और मोतियों को परेशान किए बिना सभी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें। हवा के बारे में दो से पांच मिनट के लिए नमूनों को सूखा.पीएच 8 के 10-मिलीमोलर ट्राईस हाइड्रोक्लोराइड के 37.5 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्लेट को एक चुंबकीय रैक पर वापस रखें और मोतियों को पांच मिनट के लिए बांधने की अनुमति दें। एक ताजा thermocycler-संगत 96-अच्छी तरह से प्लेट के लिए supernatant के 36.5 microliters स्थानांतरण और मोतियों को त्याग.सेल गुणवत्ता मूल्यांकन करने के बाद, सेल उपस्थिति और प्रतिशत की जांच की गई, यह दर्शाते हुए कि कम गुणवत्ता वाले भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। एकल-सेल सॉर्टिंग होचस्ट 33342 दाग का उपयोग करके किया गया था, और परीक्षण कोशिकाओं को या तो शून्य या प्रत्येक कुएं में एक सेल पाया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए गिना गया था। Agarose जेल विश्लेषण एक कम आणविक वजन सीढ़ी और व्यक्तिगत एकल सेल uliCUT और भागो पुस्तकालयों से पता चला.सबऑप्टिमल और इष्टतम पुस्तकालय विश्लेषण एक कम आणविक वजन सीढ़ी, अक्षम Mnase पाचन के कारण suboptimal पुस्तकालय, और उचित पाचन के साथ सफल पुस्तकालय दिखाते हैं। फ़्रेग्मेंट विश्लेषक वितरण से पता चलता है कि एकल-कक्ष का अपेक्षित आकार 150 से 500 आधार जोड़े तक होता है. हालांकि, बड़े प्रोटीन में, डीएनए में लगभग 270 आधार जोड़े होंगे।उच्च सेल संख्या या नकारात्मक नियंत्रण और एकल-सेल CTCF uliCUT & RUN को दर्शाने वाले एकल-लोकस जीनोम ब्राउज़र का उपयोग करके प्रोटीन अधिभोग से पता चला है कि एकल-सेल काफी हद तक उच्च-सेल यूलिकट और रन के समान मजबूत चोटियों का प्रतिनिधित्व करता है। एकल-सेल CTCF या नकारात्मक नियंत्रण के गर्मी मानचित्रों ने कोशिकाओं में स्थापित CTCF बाध्यकारी साइटों पर सीधे पठन संवर्धन के एक स्पष्ट पैटर्न का खुलासा किया। एक आयामी गर्मी मानचित्र आसपास के क्षेत्रों और नो-एंटीबॉडी नियंत्रणों के सापेक्ष एकल-सेल पुस्तकालयों में स्थापित सीटीसीएफ बाध्यकारी साइटों पर एक उच्च पठन घनत्व दिखाते हैं, जो स्थापित बाध्यकारी साइटों पर एंटीबॉडी-विशिष्ट संवर्धन का प्रदर्शन करते हैं।बर्फ के पानी के स्नान पर मनका-बाउंड नाभिक को संतुलित करना और कैल्शियम क्लोराइड के अलावा पर नमूने को ओवरहीटिंग नहीं करना क्रोमैटिन के अधिक पाचन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

जीनोम चौड़ा चिप का उपयोग isoform विशेष जीन लक्ष्य पहचानें विश्लेषण

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

वयस्क माउस cardiomyocytes की सिंगल सेल transcriptional रूपरेखा

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Chromatin immunoprecipitation (चिप) का उपयोग ड्रोसोफिला ऊतक

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

नैनो फेम: प्रोटीन फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का स्थानीयकरण

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

बायोमास की को सीमित करना राशियाँ का उपयोग करते हुए कुशल chromatin immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

प्लास्मिड वैक्टर की पीढ़ी गिब्सन विधानसभा का उपयोग मानव बढ़ाव फैक्टर-1α प्रमोटर के विनियमन के तहत झंडा टैग प्रोटीन व्यक्त

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र और enChIP द्वारा एसोसिएटेड अणु की पहचान का अलगाव

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

एकल जांच के आवेदन: मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग और परिवेश की स्थिति के तहत सिंगल सेल विश्लेषण

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

ठहराव of Site-विशिष्ट प्रोटीन Lysine Acetylation और Succinylation Stoichiometry का उपयोग डाटा-स्वतंत्र अधिग्रहण जन स्पेक्ट्रोमेट्री

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...