Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Ringraziamo i membri dell'Hainer Lab per aver letto e commentato una versione precedente di questo manoscritto. Questo progetto ha utilizzato il NextSeq500 disponibile presso l'Università di Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core presso l'UPMC Children's Hospital di Pittsburgh per il sequenziamento con un ringraziamento speciale al suo direttore, William MacDonald. Questa ricerca è stata supportata in parte dal Center for Research Computing dell'Università di Pittsburgh attraverso le risorse informatiche fornite. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (a S.J.H.).

Dichiarazione etica: Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Office of Research Protections presso l'Università di Pittsburgh.
1. Preparare perline magnetiche
NOTA: eseguire prima dell'ordinamento delle celle e tenere premuto il ghiaccio fino all'uso.
<ol><li>Pipettare 30 μL di microsfere paramagnetiche coniugate conA miscela di liquami di perline per reazione a un tubo di microfuga fresco da 1,5 mL e aggiungere 850 μL...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN è un protocollo efficace per determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina. Ha molti vantaggi rispetto ad altri protocolli, tra cui: 1) elevato rapporto segnale-rumore, 2) protocollo rapido e 3) bassa copertura di lettura di sequenziamento richiesta, portando così a risparmi sui costi. L'uso della proteina A- o proteina A/G-MNasi consente di applicare CUT&RUN con qualsiasi anticorpo disponibile; pertanto, ha il potenziale per profilare rapidamente e facilmente molte proteine. Tuttavia, l'adattame...

Molte proteine nucleari funzionano interagendo con la cromatina per promuovere o prevenire attività modellate sul DNA. Per determinare la funzione di queste proteine che interagiscono con la cromatina, è importante identificare le posizioni genomiche in cui queste proteine sono legate. Dal suo sviluppo nel 1985, l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stata il gold standard per identificare dove una proteina si lega alla cromatina 1,2. La tecnica ChIP tradizionale ha il seguente flusso di lavoro di base: le cellule vengono raccolte e reticolate (di solito con formaldeide), la cromatina viene tagliata (di solito con metodi di sonicazione aggressivi, che richiedono la reticolazione), la proteina di interesse è immunoprecipitata usando un anticorpo che prende di mira la proteina (o la proteina marcata) seguita da un anticorpo secondario (accoppiato ad agarosio o perline magnetiche), la reticolazione è invertita, proteine e RNA vengono digeriti per purificare il DNA e questo DNA arricchito con ChIP viene utilizzato come modello per l'analisi (utilizzando sonde radiomarcate 1,2, qPCR3, microarray 5,6 o sequenziamento4). Con l'avvento dei microarray e del sequenziamento profondo massicciamente parallelo, ChIP-chip 5,6 e ChIP-seq4 sono stati sviluppati più recentemente e consentono l'identificazione a livello di genoma della localizzazione delle proteine sulla cromatina. Il Crosslinking ChIP è stata una tecnica potente e affidabile sin dal suo avvento con importanti progressi nella risoluzione da parte di ChIP-exo7 e ChIP-nexus8. Parallelamente allo sviluppo di ChIP-seq, sono stati stabiliti protocolli nativi (non reticolanti) per ChIP (N-ChIP), che utilizzano la digestione della nucleasi (spesso utilizzando nucleasi micrococcica o MNasi) per frammentare la cromatina, al contrario della sonicazione eseguita nelle tradizionali tecniche ChIP di reticolazione9. Tuttavia, uno dei principali svantaggi delle tecnologie ChIP e N-ChIP è stato il requisito di un elevato numero di cellule a causa della bassa resa del DNA a seguito della manipolazione sperimentale. Pertanto, in anni più recenti, molti sforzi sono stati verso l'ottimizzazione delle tecnologie ChIP per l'input a bassa cella. Questi sforzi hanno portato allo sviluppo di molte potenti tecnologie basate su ChIP che variano nella loro applicabilità e requisiti di input 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Tuttavia, le tecnologie basate su ChIP-seq a singola cellula sono state carenti, specialmente per le proteine non istoniche.
Nel 2004 è stata sviluppata una tecnologia alternativa per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina denominata Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) e Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Queste tecniche a singolo locus utilizzano una fusione di MNase alla proteina di interesse (ChEC) o alla proteina A (ChIC) per il taglio diretto del DNA adiacente alla proteina di interesse. In anni più recenti, sia ChEC che ChIC sono stati ottimizzati per la profilazione proteica a livello di genoma sulla cromatina (ChEC-seq e CUT&RUN, rispettivamente)20,21. Mentre ChEC-seq è una tecnica potente per determinare la localizzazione dei fattori, richiede lo sviluppo di proteine di fusione MNasi per ciascun bersaglio, mentre ChIC e la sua variazione a livello di genoma, CUT & RUN, si basano su un anticorpo diretto verso la proteina di interesse (come con ChIP) e la proteina ricombinante A-MNasi, dove la proteina A può riconoscere la regione costante IgG dell'anticorpo. In alternativa, è stata sviluppata una proteina di fusione A/proteina G-MNasi (pA/G-MNasi) in grado di riconoscere una gamma più ampia di regioni di costante anticorpale22. CUT&RUN è diventato rapidamente un'alternativa popolare a ChIP-seq per determinare la localizzazione delle proteine su tutto il genoma della cromatina.
Nel 201923 è stato descritto l'input ultra-basso CUT&RUN (uliCUT&RUN), una variante di CUT&RUN che consente l'uso di ingressi a cella bassa e singola. Qui viene descritta la metodologia per un'applicazione manuale a cella singola con formato a 96 pozzetti. È importante notare che dallo sviluppo di uliCUT&RUN, sono state sviluppate due alternative per la profilazione degli istoni, CUT&Tag e iACT-seq, fornendo una profilazione robusta e altamente parallela delle proteine istoniche 24,25. Inoltre, scCUT&Tag è stato ottimizzato per profilare più fattori in una singola cellula (multiCUT&Tag) e per l'applicazione a proteine non istoniche26. Insieme, CUT&RUN fornisce un'alternativa interessante al ChIP-seq a basso input in cui uliCUT&RUN può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare che abbia accesso a una selezionatrice cellulare e a un'apparecchiatura standard.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Determinare le posizioni di legame di una proteina sulla cromatina è essenziale per comprenderne la funzione e i potenziali obiettivi regolatori. L'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stata il gold standard per determinare la localizzazione delle proteine per oltre 30 anni ed è definita dall'uso di un anticorpo per estrarre la proteina di interesse dalla cromatina sonicata o digerita enzimaticamente. Più recentemente, le tecniche di tethering degli anticorpi sono diventate popolari per valutare la localizzazione delle proteine sulla cromatina a causa della loro maggiore sensibilità. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) è il derivato genome-wide di Chromatin Immunocleavage (ChIC) e utilizza la proteina A ricombinante legata alla nucleasi micrococcica (pA-MNasi) per identificare la regione costante IgG dell'anticorpo che prende di mira una proteina di interesse, consentendo così la scissione sito-specifica del DNA che fiancheggia la proteina di interesse. CUT&RUN può essere utilizzato per profilare le modificazioni istoniche, i fattori di trascrizione e altre proteine leganti la cromatina come i fattori di rimodellamento dei nucleosomi. È importante sottolineare che CUT&RUN può essere utilizzato per valutare la localizzazione di proteine associate a eucromatiche o eterocromatiche e modifiche istoniche. Per questi motivi, CUT&RUN è un metodo potente per determinare i profili di legame di una vasta gamma di proteine. Recentemente, CUT&RUN è stato ottimizzato per la profilazione del fattore di trascrizione in basse popolazioni di cellule e singole celle e il protocollo ottimizzato è stato definito CUT&RUN a bassissimo input (uliCUT&RUN). Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la profilazione del fattore a cella singola utilizzando uliCUT & RUN in un formato manuale a 96 pozzetti.

Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la profilazione della proteina monocellulare sulla cromatina utilizzando un formato manuale a 96 pozzetti uliCUT & RUN. Mentre i risultati varieranno in base alla proteina profilata (a causa dell'abbondanza di proteine e della qualità degli anticorpi), al tipo di cellula e ad altri fattori che contribuiscono, i risultati attesi per questa tecnica sono discussi qui. La qualità cellulare (aspetto cellulare e percentuale di cellule vitali) e lo smistamento di singole cel...

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Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN e le sue varianti possono essere utilizzati per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina. Questo protocollo descrive come determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina utilizzando uliCUT&RUN a singola cellula.

Localizzazione del fattore a cella singola sulla cromatina utilizzando la scissione di input ultra-bassa sotto i bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN è una potente tecnica per determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina, e qui descriviamo una versione a singola cellula di questa tecnica in un formato manuale a 96 pozzetti. La maggior parte delle tecniche di localizzazione delle proteine, come ChIP-seq, richiedono un elevato input cellulare e richiedono circa tre giorni per essere completate. CUT&RUN, a causa del segnale elevato e dello sfondo basso, è stato ottimizzato per applicazioni a bassa cella e a cella singola e può essere completato in un solo giorno.Immaginiamo che questa tecnica possa essere applicata a quasi tutti i campioni biologici e possa essere particolarmente potente per determinare la localizzazione dei fattori in campioni rari e a bassa abbondanza, come preziosi campioni di pazienti. Prima di eseguire qualsiasi esperimento su una singola cellula, testare l'anticorpo e la tecnica su un numero elevato di cellule non preziose. Il principale limite di questo esperimento è la dipendenza da un anticorpo robusto.A dimostrare la procedura è Santana Lardo, un'esperta specialista di ricerca del mio laboratorio. Dopo aver selezionato le singole cellule e legando i nuclei alle perline, posizionare la piastra a 96 pozzetti su un rack magnetico a 96 pozzetti e lasciare che le perline si leghino per un minimo di cinque minuti. Quindi, rimuovere e scartare il surnatante.Aggiungere 100 microlitri di tampone di blocco alle perle legate al nucleo, mescolare con un leggero pipettaggio e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di cinque minuti. Quindi, rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.Rimuovere la piastra dal rack magnetico e risospesciare le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio per reazione con un pipettaggio delicato. Riposizionare la piastra sul rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Risospese le perline in 25 microlitri di tampone di lavaggio per reazione con un pipettaggio delicato.Creare una miscela principale di anticorpi primari aliquotando 25 microlitri di tampone di lavaggio per reazione e quindi aggiungere 0,5 microlitri di anticorpi per reazione. Aggiungere 25,5 microlitri della miscela tampone di lavaggio degli anticorpi, seguiti da un delicato pipettaggio a ciascun campione trattato con un anticorpo mirato alla proteina di interesse. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.Quindi, riposizionare i campioni sul rack magnetico a 96 pozzetti. Una volta che il surnatante è chiaro, rimuoverlo e scartarlo senza disturbare le perline. Dopo aver rimosso la piastra dal rack magnetico, lavare le perline con 100 microlitri di tampone di lavaggio e risospesciare mediante pipettaggio.Dopo aver riposto la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e aver scartato il surnatante come dimostrato in precedenza, risospese ogni campione in 25 microlitri di tampone di lavaggio. Crea una miscela master di proteina A MNasi aggiungendo 25 microlitri di tampone di lavaggio e una quantità ottimizzata di proteina A MNasi per reazione. Aggiungere 25 microlitri di miscela principale di MNasi di proteina A a ciascun campione, compresi i campioni di controllo.Incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti. Lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di cinque minuti e poi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.Dopo aver rimosso la piastra dal rack magnetico, lavare le perline con 100 microlitri di tampone di lavaggio e risospesciare delicatamente con un tubolare delicato. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza. Quindi, rimuovere i campioni dal rack magnetico e risospesciare le perline in 50 microlitri di tampone di lavaggio mediante un delicato pipettaggio.Equilibrare i campioni a zero gradi Celsius in una miscela di acqua ghiacciata per cinque minuti e quindi rimuovere i campioni dal bagno di acqua ghiacciata. Aggiungere un microlitro di cloruro di calcio da 100 millimolari usando una pipetta multicanale. Mescolare bene da tre a cinque volte con un pipettaggio delicato utilizzando una pipetta multicanale di grande volume e quindi riportare i campioni a zero gradi Celsius.Avviare un timer di 10 minuti non appena la piastra è tornata nel bagno di acqua ghiacciata. Arrestare la reazione pipettando 50 microlitri di una soluzione contenente il doppio della concentrazione di RSTOP+ e tamponare in ciascun pozzetto nello stesso ordine in cui è stato aggiunto il cloruro di calcio. Incubare i campioni per 20 minuti a 37 gradi Celsius.Ruotare la piastra a 16.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti. Lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di cinque minuti.Quindi, trasferire i supernatanti in un piatto fresco da 96 pozzetti e scartare le perline. Per l'estrazione del DNA, aggiungere un microlitro di 10% SDS e 0,83 microlitri di 20 milligrammi per millilitro proteinasi K a ciascun campione e mescolare i campioni mediante pipettaggio delicato. Incubare i campioni per 10 minuti a 70 gradi Celsius.Riportare la piastra a temperatura ambiente. Aggiungere 46,6 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e 90 microlitri da 50% PEG4000 e mescolare delicatamente con pipettaggio. Aggiungere 33 microlitri di perle di polistirene magnetite a ciascun campione e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.Posizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che il surnatante si schiarisca per circa cinque minuti. Quindi, scartare con attenzione il surnatante senza disturbare le perline. Risciacquare due volte con 150 microlitri di etanolo all'80% senza disturbare le perline.Ruotare brevemente la piastra a 1000 volte G per 30 secondi. Riposizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e rimuovere tutto l'etanolo residuo senza disturbare le perline. Asciugare all'aria i campioni per circa due-cinque minuti.Sospendere le perline in 37,5 microlitri di 10 millimolari TRIS cloridrato di pH 8 e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Riposizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che le perline si leghino per cinque minuti. Trasferire 36,5 microlitri del surnatante in una piastra a 96 pozzetti compatibile con termociclatore fresco ed eliminare le perline.Dopo aver eseguito la valutazione della qualità cellulare, sono stati esaminati l'aspetto e la percentuale delle cellule, dimostrando che le cellule staminali embrionali di bassa qualità non dovrebbero essere utilizzate. Lo smistamento a cella singola è stato eseguito utilizzando la colorazione Hoechst 33342 e le celle di prova sono state contate per garantire che in ogni pozzo si trovi zero o una cella. L'analisi del gel di agarosio ha rivelato una scala a basso peso molecolare e singole librerie uliCUT&RUN a singola cellula.L'analisi della libreria non ottimale e ottimale mostra una scala a basso peso molecolare, una libreria non ottimale a causa dell'inefficiente digestione Mnase e una libreria di successo con una digestione appropriata. La distribuzione dell'analizzatore di frammenti mostra che la dimensione prevista della singola cella varia da 150 a 500 coppie di basi. Tuttavia, nelle grandi proteine, il DNA avrà circa 270 coppie di basi.L'occupazione delle proteine utilizzando il browser del genoma a singolo locus raffigurante un numero elevato di cellule o un controllo negativo e il CTCF a singola cellula uliCUT & RUN ha rivelato che la singola cellula rappresentava in gran parte picchi forti, simili a uliCUT & RUN ad alta cellula. Le mappe termiche del CTCF a cella singola o del controllo negativo hanno rivelato un chiaro modello di arricchimento della lettura direttamente sui siti di legame CTCF stabiliti nelle cellule. Le mappe di calore unidimensionali mostrano una maggiore densità di lettura rispetto ai siti di legame CTCF stabiliti nelle librerie a singola cellula rispetto alle regioni circostanti e ai controlli senza anticorpi, dimostrando l'arricchimento anticorpo-specifico nei siti di legame stabiliti.Equilibrare i nuclei legati alle perline sul bagno di acqua ghiacciata e non surriscaldare il campione dopo l'aggiunta di cloruro di calcio è importante per prevenire l'eccessiva digestione della cromatina.

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