Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

この原稿の以前のバージョンを読んでコメントしてくれたHainer Labのメンバーに感謝します。このプロジェクトでは、ピッツバーグのUPMC小児病院にあるピッツバーグ大学健康科学シーケンシングコアで入手可能なNextSeq500を使用して、ディレクターのウィリアム・マクドナルドに特別な感謝を込めてシーケンシングを行いました。この研究は、提供されたコンピュータリソースを通じて、ピッツバーグ大学研究コンピューティングセンターによって部分的に支援されました。この研究は、国立衛生研究所助成金番号R35GM133732(S.J.H.宛)の支援を受けた。

倫理的声明:すべての研究は、ピッツバーグ大学のInstitutional Biosafety Office of Research Protectionsによって承認されました。
1. 磁気ビーズの調製
メモ:細胞選別の前に行い、使用するまで氷の上に保持してください。
<ol><li>反応ごとに30 μLのConA結合常磁性微小球ビーズスラリーを新鮮な1.5 mLマイクロフュージチューブに混合し、850 μLの結合バ?...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUNは、クロマチン上のタンパク質の局在を決定するための効果的なプロトコルです。他のプロトコルと比較して、1)高い信号対雑音比、2)高速プロトコル、3)必要なシーケンシング読み取りカバレッジが低いため、コスト削減につながるなど、多くの利点があります。プロテインA-またはプロテインA/G-MNaseを使用することで、CUT&RUNを利用可能な任意の抗体で適用することができます。したが...

多くの核タンパク質は、クロマチンと相互作用してDNAテンプレート化された活性を促進または防止することによって機能する。これらのクロマチン相互作用タンパク質の機能を決定するためには、これらのタンパク質が結合しているゲノム位置を特定することが重要です。1985年の開発以来、クロマチン免疫沈降法(ChIP)は、タンパク質がクロマチン1,2に結合する場所を特定するためのゴールドスタンダードとなっています。従来のChIP技術は、以下の基本的なワークフローを有する:細胞を回収し、架橋し(通常はホルムアルデヒドで)、クロマチンを剪断し(通常は架橋を必要とする過酷な超音波処理法で)、目的のタンパク質を標的とする抗体を用いて免疫沈降させ、続いて二次抗体(アガロースまたは磁気ビーズに結合)、架橋を逆転させ、 タンパク質とRNAを消化してDNAを精製し、このChIP富化DNAを分析のテンプレートとして使用します(放射性標識プローブ1、2、qPCR3、マイクロアレイ5、6、またはシーケンシング4を使用)。マイクロアレイと超並列ディープシーケンシングの出現により、ChIPチップ5,6およびChIP-seq4が最近開発され、クロマチン上のタンパク質局在のゲノムワイドな同定が可能になりました。ChIPの架橋は、ChIP-exo7およびChIP-nexus8による解像度の大幅な進歩により、その出現以来強力で信頼性の高い技術でした。ChIP-seqの開発と並行して、ChIP(N-ChIP)のネイティブ(非架橋)プロトコルが確立されており、従来の架橋ChIP技術9で行われる超音波処理とは対照的に、クロマチンを断片化するためにヌクレアーゼ消化(しばしばミクロコッカスヌクレアーゼまたはMNaseを使用する)を利用する。しかし、ChIPとN-ChIPの両方の架橋技術に対する大きな欠点の1つは、実験操作後のDNA収率が低いため、高い細胞数が必要であることです。したがって、近年では、低セル入力のためのChIP技術の最適化に向けて多くの努力が払われています。これらの努力の結果、適用性と入力要件が異なる多くの強力なChIPベースの技術が開発されました10,11,12,13,14,15,16,17,18。しかし、単一細胞ChIP-seqベースの技術は、特に非ヒストンタンパク質については欠けていた。
2004年、クロマチン内因性切断(ChEC)およびクロマチン免疫切断(ChIC)19と呼ばれるクロマチンのタンパク質占有率を決定するための代替技術が開発されました。これらの単一遺伝子座技術は、目的のタンパク質(ChEC)またはプロテインA(ChIC)のいずれかへのMNaseの融合を利用して、目的のタンパク質に隣接するDNAを直接切断します。近年、ChECとChICの両方がクロマチン(それぞれChEC-seqとCUT&RUN)上のゲノムワイドタンパク質プロファイリングに最適化されています20,21。ChEC-seqは因子の局在を決定するための強力な技術ですが、各標的に対してMNase融合タンパク質を開発する必要がありますが、ChICとそのゲノムワイドバリエーションであるCUT&RUNは、目的のタンパク質に向けられた抗体(ChIPと同様に)と組換えプロテインA-MNaseに依存しており、プロテインAは抗体のIgG定常領域を認識できます。代替として、より広い範囲の抗体定常領域を認識できる融合プロテインA/プロテインG-MNase(pA/G-MNase)が開発されている22。CUT&RUNは、クロマチンゲノムワイドでのタンパク質局在を決定するためのChIP-seqの代替手段として急速に普及しています。
超低入力CUT&RUN(uliCUT&RUN)は、低セル入力とシングルセル入力の使用を可能にするCUT&RUNのバリエーションであり、201923で説明されました。ここでは、手動の96ウェルフォーマット単一セルアプリケーションのための方法論が説明される。uliCUT&RUNの開発以来、ヒストンプロファイリングのための2つの選択肢であるCUT&TagとiACT-seqが開発され、ヒストンタンパク質の堅牢で高度に並列なプロファイリングが提供されていることに注意することが重要です24,25。さらに、scCUT&Tagは、単一細胞内の複数の因子のプロファイリング(multiCUT&Tag)および非ヒストンタンパク質への適用のために最適化されている26。CUT&RUNは、細胞ソーターと標準機器にアクセスできる分子生物学ラボでuliCUT&RUNを実行できる低入力ChIP-seqの魅力的な代替手段を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

クロマチン上のタンパク質の結合位置を決定することは、その機能および潜在的な調節標的を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降(ChIP)は、30年以上にわたりタンパク質の局在を決定するためのゴールドスタンダードであり、超音波処理または酵素消化クロマチンから目的のタンパク質を引き出すための抗体の使用によって定義されています。より最近では、抗体テザリング技術は、その感度の増加のためにクロマチン上のタンパク質局在を評価するために普及している。Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) は、クロマチン免疫切断 (ChIC) のゲノムワイド誘導体であり、ミクロコッカスヌクレアーゼ (pA-MNase) に連結された組換えプロテイン A を利用して、目的のタンパク質を標的とする抗体の IgG 定常領域を同定し、目的のタンパク質に隣接する DNA の部位特異的切断を可能にします。CUT&RUNは、ヒストン修飾、転写因子、およびヌクレオソームリモデリング因子などの他のクロマチン結合タンパク質をプロファイリングするために使用することができる。重要なことに、CUT&RUNは、真色または異色に関連するタンパク質およびヒストン修飾のいずれかの局在化を評価するために使用することができる。これらの理由から、CUT&RUNは広範囲のタンパク質の結合プロファイルを決定するための強力な方法です。最近、CUT&RUNは低集団の細胞および単一細胞における転写因子プロファイリングに最適化されており、最適化されたプロトコルは超低入力CUT&RUN(uliCUT&RUN)と呼ばれています。ここでは、uliCUT&RUNを使用した単一細胞因子プロファイリングのための詳細なプロトコルを、手動の96ウェル形式で提示する。

ここでは、96ウェルの手動フォーマットuliCUT&RUNを使用してクロマチン上の単一細胞タンパク質プロファイリングのための詳細なプロトコルを提示する。結果は、プロファイリングされるタンパク質(タンパク質の存在量および抗体品質による)、細胞型、およびその他の寄与因子によって異なるが、この技術の予想される結果については、ここで説明する。細胞品質(細胞の外観および生細胞の?...

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Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。

標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUNはクロマチン上のタンパク質の局在を決定するための強力な技術であり、ここではこの技術の単一細胞バージョンを手動の96ウェル形式で説明します。ChIP-seqのようなほとんどのタンパク質局在化技術は、高い細胞入力を必要とし、完了までに約3日かかります。CUT&RUNは、高信号と低バックグラウンドのため、ローセルおよびシングルセルアプリケーション向けに最適化されており、1日で完了できます。この技術は、ほぼすべての生物学的サンプルに適用でき、貴重な患者サンプルなどの希少で存在量の少ないサンプルにおける因子の局在を決定するのに特に強力であると想定しています。単一細胞実験を行う前に、抗体と技術を多数の非貴重細胞でテストしてください。この実験の主な限界は、堅牢な抗体への依存性です。手順を実演しているのは、私の研究室の経験豊富な研究専門家であるサンタナ・ラルドです。単一細胞を選別し、ビーズに核を結合させた後、96ウェルプレートを96ウェル磁気ラックの上に置き、ビーズが最低5分間結合するのを許します。その後、上澄み液を取り出して廃棄する。100マイクロリットルのブロッキングバッファーを核結合ビーズに加え、穏やかなピペッティングで混合し、室温で5分間インキュベートする。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、上清を最低 5 分間除去します。その後、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して廃棄する。磁気ラックからプレートを取り出し、穏やかなピペッティングで反応ごとにビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。プレートを 96 ウェル磁気ラックに戻し、上清が除去されるのを待ってから、上清を取り出して廃棄します。穏やかなピペッティングで反応ごとに25マイクロリットルの洗浄バッファーにビーズを再懸濁する。反応ごとに25マイクロリットルの洗浄バッファーを小分けして一次抗体マスター混合物を作り、次いで反応ごとに0.5マイクロリットルの抗体を加える。25.5マイクロリットルの抗体洗浄バッファーミックスを加え、続いて、目的のタンパク質を標的とする抗体で処理されている各サンプルに穏やかにピペッティングを行った。室温で1時間インキュベートする。その後、サンプルを再び96ウェル磁気ラックに戻します。上清が透明になったら、ビーズを邪魔することなく取り除いて捨ててください。磁気ラックからプレートを取り出した後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、ピペッティングで再懸濁します。プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、前述のように上清を捨てた後、各サンプルを25マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。プロテイン A MNase マスター混合物は、25 マイクロリットルの洗浄バッファーと、反応ごとに最適化された量のプロテイン A MNase を加えて作成します。25マイクロリットルのプロテインA MNaseマスター混合物を、対照試料を含む各試料に加える。試料を室温で30分間インキュベートする。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置きます。上澄み液を最低5分間クリアしてから、ビーズを乱すことなく上清を取り出して捨てます。磁気ラックからプレートを取り出した後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、穏やかなピペッティングで再懸濁します。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、前述のように上清を捨てます。その後、磁気ラックからサンプルを取り出し、穏やかなピペッティングによってビーズを50マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁する。氷水混合物中でサンプルを摂氏0度まで5分間平衡化してから、氷水浴からサンプルを取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して1マイクロリットルの100ミリモルの塩化カルシウムを加える。大容量のマルチチャンネルピペットを使用して穏やかなピペッティングで3〜5回よく混ぜ合わせ、サンプルを摂氏0度に戻します。プレートが氷水浴に戻ったらすぐに10分のタイマーを開始します。2倍の濃度のRSTOP+を含む溶液50マイクロリットルをピペッティングして反応を停止し、塩化カルシウムと同じ順序で緩衝液を各ウェルに添加した。サンプルを摂氏37度で20分間インキュベートする。プレートを16, 000倍Gで4°Cで5分間回転させます。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置きます。上清を最低5分間クリアします。その後、上清を新鮮な96ウェルプレートに移し、ビーズを捨てる。DNA抽出のために、10%SDSの1マイクロリットルと1ミリリットルのプロテイナーゼKあたり0.83マイクロリットルの20ミリグラムを各サンプルに加え、穏やかなピペッティングによってサンプルを混合する。サンプルを摂氏70度で10分間インキュベートする。プレートを室温に戻します。46.6マイクロリットルの5モルの塩化ナトリウムと90マイクロリットルの50%PEG4000を加え、穏やかなピペッティングで混合する。各サンプルに33マイクロリットルのポリスチレンマグネタイトビーズを加え、室温で10分間インキュベートする。プレートを磁気ラックの上に置き、上澄み液を約5分間透明にします。その後、ビーズを乱すことなく上澄み液を慎重に捨てる。ビーズを乱すことなく、150マイクロリットルの80%エタノールで2回すすいでください。プレートを1000倍Gで30秒間短時間回転させる。プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、ビーズを乱すことなく残留エタノールをすべて除去します。サンプルを約2〜5分間空気乾燥させます。ビーズをpH8の10ミリモルTRIS塩酸塩37.5マイクロリットルに再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。プレートを磁気ラックに戻し、ビーズが 5 分間結合するのを許します。36.5マイクロリットルの上清を新鮮なサーモサイクラー対応の96ウェルプレートに移し、ビーズを捨てる。細胞品質評価を実施した後、細胞の外観およびパーセンテージを調べ、低品質の胚性幹細胞を使用すべきではないことを実証した。単一細胞ソーティングをヘキスト33342染色を用いて行い、試験細胞を計数して、各ウェルに0個または1個の細胞が見出されることを確認した。アガロースゲル分析により、低分子量ラダーと個々の単一細胞uliCUT&RUNライブラリーが明らかになった。最適でないライブラリー分析および最適ライブラリー分析は、低分子量はしご、非効率なムナーゼ消化による最適でないライブラリー、および適切な消化を伴う成功したライブラリーを示す。フラグメントアナライザー分布は、単一細胞の予想されるサイズが150〜500塩基対の範囲であることを示している。しかし、大きなタンパク質では、DNAは約270塩基対を有するであろう。高細胞数または陰性対照を描写した単一遺伝子座ゲノムブラウザと単一細胞CTCF uliCUT&RUNを用いたタンパク質占有率は、単一細胞が高細胞uliCUT&RUNと同様に、主に強いピークを表すことを明らかにした。単一細胞CTCFまたはネガティブコントロールのヒートマップは、細胞内の確立されたCTCF結合部位に直接かかる読み取り濃縮の明確なパターンを明らかにした。1次元ヒートマップは、単一細胞ライブラリーの確立されたCTCF結合部位よりも、周囲の領域および抗体のない対照と比較して高い読み取り密度を示し、確立された結合部位における抗体特異的濃縮を実証する。氷水浴上でビーズ結合核を平衡化し、塩化カルシウム添加時にサンプルを過熱させないことは、クロマチンの過剰消化を防ぐために重要です。

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

生物学

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

ギブソンアセンブリを使用して、ヒト伸長因子1αプロモーターの制御下でFLAGタグ化タンパク質を発現するプラスミドベクターの作製

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

シングルプローブの応用：周囲条件下での質量分析イメージングと単一細胞解析

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...