Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

이 원고의 이전 버전에 대한 읽고 의견을 보내 주신 Hainer Lab 회원들에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 피츠버그 UPMC 아동 병원의 피츠버그 건강 과학 시퀀싱 코어에서 사용할 수있는 NextSeq500을 사용하여 윌리엄 맥도날드 (William MacDonald) 이사에게 특별한 감사의 말을 전했습니다. 이 연구는 피츠버그 대학 연구 컴퓨팅 센터 (University of Pittsburgh Center for Research Computing)가 제공된 컴퓨터 리소스를 통해 부분적으로 지원했습니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health Grant Number) R35GM133732 (S.J.H.)의 지원을 받았다.

윤리 성명서 : 모든 연구는 피츠버그 대학의 기관 생물 안전 연구 보호 사무소의 승인을 받았습니다.
1. 마그네틱 비드 준비
참고: 셀 정렬 전에 수행하고 사용할 때까지 얼음을 유지하십시오.
<ol><li>피펫 30 μL의 ConA-공액 상자성 마이크로스피어 비드 슬러리 믹스를 신선한 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에 반응시키고 850 μL의 결합 버퍼를 첨가하고...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN은 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 효과적인 프로토콜입니다. 1) 높은 신호 대 잡음비, 2) 빠른 프로토콜 및 3) 낮은 시퀀싱 읽기 커버리지가 필요하므로 비용 절감으로 이어지는 등 다른 프로토콜에 비해 많은 이점이 있습니다. 단백질 A- 또는 단백질 A/G-MNase의 사용은 CUT&RUN이 사용 가능한 모든 항체와 함께 적용될 수 있게 합니다. 따라서 많은 단백질을 빠르고 쉽게 프로파일 링 할...

많은 핵 단백질은 크로마틴과 상호작용하여 DNA 주형 활동을 촉진하거나 예방함으로써 기능한다. 이러한 크로마틴 상호작용 단백질의 기능을 결정하기 위해서는 이들 단백질이 결합하는 게놈 위치를 확인하는 것이 중요하다. 1985년 개발 이래, 크로마틴 면역침전(ChIP)은 단백질이 크로마틴 1,2에 결합하는 위치를 확인하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 전통적인 ChIP 기술은 다음과 같은 기본 워크 플로우를 가지고 있습니다 : 세포를 수확하고 가교 (일반적으로 포름 알데히드와 함께), 크로마틴은 전단 (일반적으로 가혹한 초음파 처리 방법, 가교 결합이 필요함), 관심있는 단백질은 단백질 (또는 태그가 지정된 단백질)을 표적으로 한 항체를 사용하여 면역 침전되고 보조 항체 (아가로스 또는 자기 비드에 결합), 가교는 역전되고, 단백질과 RNA는 DNA를 정제하기 위해 소화되며, 이 ChIP 농축-DNA는 분석용 주형으로 사용된다(방사성 표지된 프로브1,2, qPCR3, 마이크로어레이 5,6 또는 시퀀싱4 사용). 마이크로어레이의 출현과 대규모 병렬 딥 시퀀싱과 함께, ChIP-chip 5,6 및 ChIP-seq4는 최근에 개발되어 크로마틴에 대한 단백질 국소화의 게놈 전체 동정을 가능하게 한다. 가교 결합 ChIP는 ChIP-exo7 및 ChIP-nexus8의 해상도가 크게 발전한 이래로 강력하고 신뢰할 수있는 기술이었습니다. ChIP-seq의 개발과 병행하여, 전통적인 가교 ChIP 기술에서 수행되는 초음파 처리와는 대조적으로 크로마틴을 단편화하기 위해 뉴클레아제 소화 (종종 미세 구균 뉴클레아제 또는 MNase를 사용함)를 활용하는 ChIP (N-ChIP)에 대한 천연 (비 가교) 프로토콜이 확립되었습니다9. 그러나, 가교결합 ChIP 및 N-ChIP 기술 둘 다에 대한 하나의 주요한 단점은 실험 조작에 따른 낮은 DNA 수율로 인해 높은 세포 수에 대한 요구였다. 따라서 최근 몇 년 동안 낮은 셀 입력을 위해 ChIP 기술을 최적화하려는 많은 노력이 이루어졌습니다. 이러한 노력으로 인해 적용 가능성과 입력 요구 사항10,11,12,13,14,15,16,17,18에 따라 다양한 강력한 ChIP 기반 기술이 개발되었습니다. 그러나, 단일 세포 ChIP-seq 기반 기술은 특히 비히스톤 단백질에 대해 결여되어 있다.
2004년, 크로마틴 내인성 절단(ChEC) 및 크로마틴 면역절단(ChIC)19로 불리는 크로마틴의 단백질 점유율을 결정하기 위한 대체 기술이 개발되었다. 이러한 단일 유전자좌 기술은 관심있는 단백질에 인접한 DNA를 직접 절단하기 위해 관심있는 단백질 (ChEC) 또는 단백질 A (ChIC)에 MNase의 융합을 활용합니다. 보다 최근 몇 년 동안, ChEC와 ChIC 모두 크로마틴(각각 ChEC-seq 및 CUT&RUN)20,21 상의 게놈 전체 단백질 프로파일링에 최적화되었다. ChEC-seq는 인자 국소화를 결정하는 강력한 기술이지만, 각 표적에 대한 MNase-융합 단백질을 개발해야 하는 반면, ChIC와 그 게놈 전반의 변이인 CUT&RUN은 관심있는 단백질(ChIP와 마찬가지로)과 재조합 단백질 A-MNase로 향하는 항체에 의존하며, 여기서 단백질 A는 항체의 IgG 불변 영역을 인식할 수 있다. 대안으로서, 더 넓은 범위의 항체 불변 영역(22)을 인식할 수 있는 융합 단백질 A/단백질 G-MNase(pA/G-MNase)가 개발되었다. CUT&RUN은 크로마틴 게놈 전반에 대한 단백질 국소화를 결정하기 위한 ChIP-seq 에 대한 대중적인 대안이 되었다.
초저 입력 CUT&RUN(uliCUT&RUN)은 로우 및 단일 셀 입력을 사용할 수 있는 CUT&RUN의 변형으로, 201923년에 기술되었습니다. 여기에서, 수동 96-웰 포맷 단일 세포 적용을 위한 방법론이 설명된다. uliCUT&RUN의 개발 이후, 히스톤 프로파일링을 위한 두 가지 대안인 CUT&Tag 및 iACT-seq 가 개발되어 히스톤 단백질24,25의 강력하고 고도로 병렬 프로파일링을 제공한다는 점에 유의해야 합니다. 또한, scCUT&Tag는 단일 세포(multiCUT&Tag)에서 다수의 인자를 프로파일링하고 비히스톤 단백질(26)에 적용하기 위해 최적화되었다. 함께, CUT&RUN은 세포 분류기 및 표준 장비에 액세스할 수 있는 모든 분자 생물학 실험실에서 uliCUT&RUN을 수행할 수 있는 낮은 입력 ChIP-seq 에 대한 매력적인 대안을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

크로마틴에서 단백질의 결합 위치를 결정하는 것은 그 기능과 잠재적 인 조절 표적을 이해하는 데 필수적입니다. 크로마틴 면역침전(ChIP)은 30년 이상 단백질 국재화를 결정하기 위한 황금 표준이었으며, 초음파 처리 또는 효소적으로 소화된 크로마틴으로부터 관심있는 단백질을 꺼내기 위한 항체의 사용에 의해 정의된다. 보다 최근에, 항체 테더링 기술은 그들의 증가된 민감성으로 인해 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 평가하는 데 대중화되었다. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN)는 크로마틴 면역절단(ChIC)의 게놈 전체 유도체이며, 마이크로코카 뉴클레아제(pA-MNase)에 테더링된 재조합 단백질 A를 사용하여 관심있는 단백질을 표적으로 하는 항체의 IgG 불변 영역을 확인함으로써 관심있는 단백질을 플랭킹하는 DNA의 부위-특이적 절단을 가능하게 한다. CUT&RUN은 히스톤 변형, 전사 인자 및 뉴클레오솜 리모델링 인자와 같은 다른 크로마틴 결합 단백질을 프로파일링하는 데 사용할 수 있습니다. 중요하게도, CUT&RUN은 유색성 또는 이색성 관련 단백질 및 히스톤 변형의 국소화를 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 이유로 CUT&RUN은 광범위한 단백질의 결합 프로파일을 결정하는 강력한 방법입니다. 최근 CUT&RUN은 낮은 세포 집단과 단일 세포에서 전사 인자 프로파일링에 최적화되었으며, 최적화된 프로토콜은 초저 입력 CUT&RUN(uliCUT&RUN)이라고 불립니다. 여기에서는 uliCUT&RUN을 사용하는 단일 세포 인자 프로파일링을 위한 상세한 프로토콜이 수동 96-웰 형식으로 제시된다.

여기에서, 96-웰 수동 포맷 uliCUT&RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단일 세포 단백질 프로파일링을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 결과는 프로파일링되는 단백질 (단백질 풍부도 및 항체 품질로 인해), 세포 유형 및 기타 기여 요인에 따라 달라질 수 있지만,이 기술에 대한 예상 결과는 여기에서 논의됩니다. 세포 품질(세포 외관 및 생존 가능한 세포의 퍼센트) 및 단일 세포 분류는 NE 버퍼로 라이...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN 및 그 변이체는 크로마틴에 대한 단백질 점유율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 단일 세포 uliCUT&RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 방법을 설명합니다.

표적 하에서 초저 입력 절단을 이용한 크로마틴에 대한 단일 세포 인자 국소화 및 뉴클레아제를 이용한 방출

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN은 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 강력한 기술이며, 여기서는 이 기술의 단일 세포 버전을 수동 96웰 형식으로 설명합니다. ChIP-seq와 같은 대부분의 단백질 국소화 기술은 높은 세포 투입이 필요하며 완료하는 데 약 사흘이 걸립니다. CUT&RUN은 높은 신호와 낮은 배경으로 인해 로우 셀 및 단일 셀 애플리케이션에 최적화되어 있으며 하루 만에 완료 할 수 있습니다.우리는이 기술이 거의 모든 생물학적 샘플에 적용될 수 있으며 귀중한 환자 샘플과 같은 희귀하고 저농축 샘플에서 인자 현지화를 결정하는 데 특히 강력 할 수 있다고 생각합니다. 단일 세포 실험을 수행하기 전에 많은 수의 귀중하지 않은 세포에 대한 항체 및 기술을 테스트하십시오. 이 실험의 주요 한계는 강건한 항체에 대한 의존성이다.이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 숙련 된 연구 전문가 인 Santana Lardo입니다. 단일 세포를 분류하고 핵을 비드에 결합시킨 후, 96-웰 플레이트를 96-웰 마그네틱 랙 상에 놓고 비드가 최소 5분 동안 결합하도록 한다. 그런 다음 상청액을 제거하고 버립니다.핵 결합 비드에 블로킹 버퍼 100 마이크로리터를 첨가하고, 부드러운 피펫팅과 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 상층액을 최소 다섯 분 동안 맑게 합니다. 그런 다음, 비드를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버린다.마그네틱 랙에서 플레이트를 제거하고 부드러운 피펫팅으로 반응 당 100 마이크로 리터의 세척 버퍼에 비드를 재현탁하십시오. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 다시 놓고 상층액을 맑게 한 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 부드러운 피펫팅으로 반응 당 25 마이크로 리터의 세척 완충액에 비드를 재현탁하십시오.반응 당 25 마이크로리터의 세척 완충액을 분취하여 일차 항체 마스터 혼합물을 만든 다음, 반응 당 0.5 마이크로리터의 항체를 첨가한다. 25.5 마이크로리터의 항체 세척 완충액 믹스를 첨가하고, 이어서 관심있는 단백질을 표적화하는 항체로 처리되는 각 샘플에 부드럽게 피펫팅하였다. 실온에서 한 시간 동안 배양한다.그런 다음 샘플을 다시 96웰 마그네틱 랙에 놓습니다. 상층액이 맑아지면 구슬을 방해하지 않고 제거하고 버리십시오. 마그네틱 랙에서 플레이트를 제거한 후, 비드를 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 세척하고 피펫팅으로 재현탁시킨다.플레이트를 다시 96-웰 마그네틱 랙 상에 놓고 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 폐기한 후, 각 샘플을 25 마이크로리터의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 반응 당 25 마이크로리터의 세척 완충액 및 최적화된 양의 단백질 A MNase를 첨가하여 단백질 A MNase 마스터 혼합물을 만든다. 25 마이크로리터의 단백질 A MNase 마스터 혼합물을 대조군 샘플을 포함한 각 샘플에 첨가한다.샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓습니다. 상청액을 최소 다섯 분 동안 맑게 한 다음 비드를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버립니다.마그네틱 랙에서 플레이트를 제거한 후, 비드를 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 세척하고 부드러운 피펫팅으로 재현탁시킨다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 앞서 시연한 바와 같이 상층액을 버립니다. 이어서, 마그네틱 랙으로부터 샘플을 제거하고, 부드러운 피펫팅에 의해 50 마이크로리터의 세척 완충액에 비드를 재현탁시킨다.샘플을 다섯 분 동안 얼음물 혼합물에서 섭씨 영도로 평형화시킨 다음, 샘플을 빙수 욕조에서 제거한다. 다채널 피펫을 사용하여 100 밀리몰 염화칼슘 1 마이크로 리터를 추가하십시오. 대용량 다중 채널 피펫을 사용하여 부드러운 피펫팅으로 세 번에서 다섯 번 잘 섞은 다음 샘플을 섭씨 영도로 되돌립니다.접시가 얼음 물 욕조에 돌아 오자마자 10 분 타이머를 시작하십시오. RSTOP+의 두 배 농도를 함유하는 용액 50 마이크로리터를 피펫팅하여 반응을 중지시키고 염화칼슘과 동일한 순서로 각 웰에 완충액을 첨가하였다. 샘플을 섭씨 37도에서 20분 동안 인큐베이션한다.플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 16, 000배 G로 회전시킵니다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓습니다. 상청액을 최소 다섯 분 동안 맑게하십시오.그런 다음 상청액을 신선한 96-웰 플레이트로 옮기고 비드를 버립니다. DNA 추출을 위해, 각 샘플에 밀리리터 당 20밀리그램의 10%SDS 및 0.83 마이크로리터의 프로테이나제 K를 첨가하고 부드러운 피펫팅으로 샘플을 혼합한다. 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 인큐베이션한다.플레이트를 실온으로 되돌립니다. 46.6 마이크로 리터의 5 몰 염화나트륨과 90 마이크로 리터의 50 % PEG4000을 넣고 부드러운 피펫팅으로 혼합하십시오. 33 마이크로리터의 폴리스티렌 마그네타이트 비드를 각 샘플에 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.플레이트를 마그네틱 랙에 놓고 상층액이 약 다섯 분 동안 맑아지도록하십시오. 그런 다음 구슬을 방해하지 않고 조심스럽게 상청액을 버리십시오. 구슬을 방해하지 않고 150 마이크로 리터의 80 % 에탄올로 두 번 헹구십시오.플레이트를 1000 배 G에서 30 초 동안 잠깐 회전시킵니다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 다시 놓고 비드를 방해하지 않고 잔류 에탄올을 모두 제거합니다. 샘플을 약 두 분에서 다섯 분 동안 공기 건조시킵니다.비드를 pH 8의 10-밀리몰 TRIS 하이드로클로라이드의 37.5 마이크로리터에 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 마그네틱 랙에 다시 놓고 비드가 다섯 분 동안 결합되도록 합니다. 36.5 마이크로리터의 상청액을 신선한 열순환기 호환 96웰 플레이트로 옮기고 비드를 버립니다.세포 품질 평가를 수행 한 후, 세포 외관과 백분율을 조사하여 품질이 낮은 배아 줄기 세포를 사용해서는 안된다는 것을 보여주었습니다. 단일 세포 분류는 Hoechst 33342 염색을 사용하여 수행되었으며, 시험 세포를 계수하여 각 웰에서 제로 또는 하나의 세포가 발견됨을 확신시켰다. 아가로스 겔 분석은 저분자량 사다리와 개별 단일 세포 uliCUT&RUN 라이브러리를 밝혀냈다.차선의 최적 라이브러리 분석은 저분자량 사다리, 비효율적인 Mnase 소화로 인한 차선의 라이브러리 및 적절한 소화를 통한 성공적인 라이브러리를 보여줍니다. 단편 분석기 분포는 단일 세포의 예상 크기가 150 내지 500 염기쌍 범위임을 보여준다. 그러나 큰 단백질에서 DNA는 약 270 염기 쌍을 가질 것입니다.높은 세포 수 또는 음성 대조군을 묘사하는 단일 유전자좌 게놈 브라우저를 사용한 단백질 점유 및 단일 세포 CTCF uliCUT&RUN은 단일 세포가 주로 높은 세포 uliCUT&RUN과 유사한 강한 피크를 나타냄을 밝혀냈다. 단일 세포 CTCF 또는 음성 대조군의 열 지도는 세포 내에 확립된 CTCF 결합 부위에 직접 판독 농축의 명확한 패턴을 밝혀냈다. 일차원 열 지도는 주변 영역 및 무항체 대조군에 비해 단일 세포 라이브러리에서 확립된 CTCF 결합 부위에 비해 더 높은 판독 밀도를 보여주며, 확립된 결합 부위에서 항체 특이적 농축을 입증한다.빙수 욕조 상에서 비드 결합된 핵을 평형화시키고 염화칼슘 첨가시 샘플을 과열시키지 않는 것은 크로마틴의 과소화를 방지하는 데 중요하다.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

연구

생물학

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

플라스미드 벡터를 생성 깁슨 어셈블리를 사용하여 인간의 신장 요인-1α의 발기인의 규정에 따라 FLAG-태그 단백질을 표현

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

단일 프로브의 응용 프로그램 : 주변 조건에서 질량 분석 이미징 및 단일 세포 분석

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...