Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Hainer Lab for lesing og kommentarer til en tidligere versjon av dette manuskriptet. Dette prosjektet brukte NextSeq500 tilgjengelig ved University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core ved UPMC Children's Hospital of Pittsburgh for sekvensering med spesiell takk til regissøren William MacDonald. Denne forskningen ble delvis støttet av University of Pittsburgh Center for Research Computing gjennom dataressursene som ble gitt. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (til S.J.H.).

Etikkerklæring: Alle studier ble godkjent av Institutional Biosafety Office of Research Protections ved University of Pittsburgh.
1. Forbered magnetiske perler
MERK: Utfør før cellesortering og hold på isen til bruk.
<ol><li>Pipette 30 μL kona-konjugerte paramagnetiske mikrosfærer per reaksjon på et friskt 1,5 ml mikrofugerør og tilsett 850 μL bindingsbuffer, pipettering forsiktig for å blande. MERK: Konakonjugerte paramagnetiske mikr...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN er en effektiv protokoll for å bestemme proteinlokalisering på kromatin. Den har mange fordeler i forhold til andre protokoller, inkludert: 1) høyt signal-til-støy-forhold, 2) rask protokoll og 3) lav sekvensering lesedekning som kreves og dermed føre til kostnadsbesparelser. Bruken av Protein A- eller Protein A/G-MNase gjør det mulig å påføre CUT&RUN med alle tilgjengelige antistoffer; Derfor har den potensial til raskt og enkelt å profilere mange proteiner. Tilpasning til encellet for proteinprofileri...

Mange kjerneproteiner fungerer ved å samhandle med kromatin for å fremme eller forhindre DNA-malaktiviteter. For å bestemme funksjonen til disse kromatin-interagerende proteinene, er det viktig å identifisere de genomiske stedene der disse proteinene er bundet. Siden utviklingen i 1985 har Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) vært gullstandarden for å identifisere hvor et protein binder seg til kromatin 1,2. Den tradisjonelle ChIP-teknikken har følgende grunnleggende arbeidsflyt: celler høstes og krysskobles (vanligvis med formaldehyd), kromatin skjæres (vanligvis med harde sonikeringsmetoder, nødvendig krysskobling), proteinet av interesse er immunoprecipitated ved hjelp av et antistoff som retter seg mot proteinet (eller merket protein) etterfulgt av et sekundært antistoff (koblet til agarose eller magnetiske perler), krysskobling er reversert, protein og RNA fordøyes for å rense DNA, og dette ChIP-beriket-DNA brukes som mal for analyse (ved hjelp av radiomerkede sonder 1,2, qPCR3, mikroarrays 5,6 eller sekvensering4). Med fremkomsten av mikroarrays og massivt parallell dyp sekvensering har ChIP-chip 5,6 og ChIP-seq4 nylig blitt utviklet og muliggjør genomomfattende identifisering av proteinlokalisering på kromatin. Crosslinking ChIP har vært en kraftig og pålitelig teknikk siden adventen med store fremskritt i oppløsning av ChIP-exo7 og ChIP-nexus8. Parallelt med utviklingen av ChIP-seq er det etablert innfødte (ikke-krysskoblingsprotokoller) for ChIP (N-ChIP), som bruker nuklease fordøyelse (ofte ved hjelp av mikrokokkkjerne eller MNase) for å fragmentere kromatinet, i motsetning til sonikering utført i tradisjonelle krysskoblings ChIP-teknikker9. Imidlertid har en stor ulempe med både krysskobling av ChIP- og N-ChIP-teknologier vært kravet til høye celletall på grunn av lavt DNA-utbytte etter eksperimentell manipulasjon. Derfor har mange de siste årene vært rettet mot å optimalisere ChIP-teknologier for lavcelleinndata. Dette arbeidet har resultert i utviklingen av mange kraftige ChIP-baserte teknologier som varierer i deres anvendbarhet og inngangskrav 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Imidlertid har encellede ChIP-seq-baserte teknologier manglet, spesielt for ikke-histone proteiner.
I 2004 ble det utviklet en alternativ teknologi for å bestemme proteinbelegg på kromatin kalt Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) og Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Disse enkelt-locus teknikker bruker en fusjon av MNase til enten protein av interesse (ChEC) eller til protein A (ChIC) for direkte kutting av DNA ved siden av protein av interesse. I de senere år har både ChEC og ChIC blitt optimalisert for genomomfattende proteinprofilering på kromatin (henholdsvis ChEC-seq og CUT&RUN)20,21. Mens ChEC-seq er en kraftig teknikk for å bestemme faktorlokalisering, krever det å utvikle MNase-fusjonsproteiner for hvert mål, mens ChIC og dens genomomfattende variasjon, CUT&RUN, er avhengig av et antistoff rettet mot proteinet av interesse (som med ChIP) og rekombinant Protein A-MNase, hvor Protein A kan gjenkjenne IgG konstant region av antistoffet. Som et alternativ er det utviklet et fusjonsprotein A /Protein G-MNase (pA/G-MNase) som kan gjenkjenne et bredere spekter av antistoffkonstantregioner22. CUT&RUN har raskt blitt et populært alternativ til ChIP-seq for å bestemme proteinlokalisering på kromatingenomom-wide.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), en variant av CUT&RUN som muliggjør bruk av lave og encellede innganger, ble beskrevet i 201923. Her beskrives metodikken for en manuell 96-brønnsformat encellet applikasjon. Det er viktig å merke seg at siden utviklingen av uliCUT&RUN har to alternativer for histoneprofilering, CUT&Tag og iACT-seq blitt utviklet, noe som gir robust og svært parallell profilering av histoneproteiner 24,25. Videre har scCUT&Tag blitt optimalisert for profilering av flere faktorer i en enkelt celle (multiCUT&Tag) og for anvendelse på ikke-histone proteiner26. Sammen gir CUT&RUN et attraktivt alternativ til lav inngang ChIP-seq der uliCUT&RUN kan utføres i ethvert molekylærbiologisk laboratorium som har tilgang til en cellesortering og standardutstyr.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Å bestemme bindingsstedene til et protein på kromatin er avgjørende for å forstå funksjonen og potensielle regulatoriske mål. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) har vært gullstandarden for å bestemme proteinlokalisering i over 30 år og er definert ved bruk av et antistoff for å trekke ut proteinet av interesse fra sonikert eller enzymatisk fordøyd kromatin. Mer nylig har antistoff tethering teknikker blitt populært for å vurdere protein lokalisering på kromatin på grunn av deres økte følsomhet. Cleavage Under Targets &release Under Nuclease (CUT&RUN) er det genom-brede derivatet av Kromatin Immunocleavage (ChIC) og benytter rekombinant protein A bundet til mikrokokkkjerne (pA-MNase) for å identifisere IgG konstant region av antistoffet rettet mot et protein av interesse, og muliggjør derfor stedsspesifikk spalting av DNA-flanken av proteinet av interesse. CUT&RUN kan brukes til å profilere histone modifikasjoner, transkripsjonsfaktorer og andre kromatinbindende proteiner som nukleosom ombyggingsfaktorer. Det er viktig at CUT&RUN brukes til å vurdere lokaliseringen av enten eukromatiske eller heterokromatiske assosierte proteiner og histone modifikasjoner. Av disse grunnene er CUT&RUN en kraftig metode for å bestemme bindingsprofilene til et bredt spekter av proteiner. Nylig har CUT&RUN blitt optimalisert for transkripsjonsfaktorprofilering i lave populasjoner av celler og enkeltceller, og den optimaliserte protokollen har blitt kalt ultra-lav input CUT&RUN (uliCUT&RUN). Her presenteres en detaljert protokoll for encellet faktorprofilering ved hjelp av uliCUT&RUN i et manuelt 96-brønns format.

Her presenteres en detaljert protokoll for encellet proteinprofilering på kromatin ved hjelp av et 96-brønns manuelt format uliCUT&RUN. Mens resultatene vil variere basert på proteinet som profileres (på grunn av proteinoverflod og antistoffkvalitet), celletype og andre medvirkende faktorer, diskuteres forventede resultater for denne teknikken her. Cellekvalitet (celleutseende og prosent av levedyktige celler) og sortering med én celle bør vurderes før eller på tidspunktet for sortering av aktive celler i NE-buff...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN og dens varianter kan brukes til å bestemme protein belegg på kromatin. Denne protokollen beskriver hvordan du bestemmer proteinlokalisering på kromatin ved hjelp av encellet uliCUT&RUN.

Lokalisering av enkeltcellefaktor på kromatin ved hjelp av ultra-lav inngangsspalting under mål og frigjøring ved hjelp av nuklease

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN er en kraftig teknikk for å bestemme proteinlokalisering på kromatin, og her beskriver vi en encellet versjon av denne teknikken i et manuelt 96-brønnsformat. De fleste proteinlokaliseringsteknikker, som ChIP-seq, krever høy celleinngang og tar omtrent tre dager å fullføre. CUT&RUN, på grunn av det høye signalet og lav bakgrunn, er optimalisert for lavcellet og encellet program, og kan fullføres på en enkelt dag.Vi ser for oss at denne teknikken kan brukes på nesten alle biologiske prøver og kan være spesielt kraftige for å bestemme faktorlokalisering i sjeldne og lave overflodsprøver, for eksempel dyrebare pasientprøver. Før du utfører noen enkeltcellede eksperimenter, test antistoffet og teknikken på et høyt antall ikke-dyrebare celler. Hovedbegrensningen i dette eksperimentet er avhengigheten av et robust antistoff.Santana Lardo, en erfaren forskningsspesialist fra laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren. Etter å ha sortert enkeltceller og bindende kjerner til perler, plasser 96-brønnsplaten på et 96-brønns magnetisk stativ og la perlene binde seg i minst fem minutter. Fjern deretter og kast supernatanten.Tilsett 100 mikroliter blokkeringsbuffer til nukleusbundne perler, bland med skånsom pipettering og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ og la supernatanten tømmes i minst fem minutter. Fjern deretter og kast supernatanten uten å forstyrre perlene.Fjern platen fra magnetstativet og resuspender perlene i 100 mikroliter vaskebuffer per reaksjon med skånsom pipettering. Plasser platen tilbake på det 96-brønns magnetiske stativet, la supernatanten tømme, og fjern og kast deretter supernatanten. Resuspend perlene i 25 mikroliter vaskebuffer per reaksjon med skånsom pipettering.Lag en primær antistoffmasterblanding ved å aliquoting 25 mikroliter vaskebuffer per reaksjon og tilsett deretter 0,5 mikroliter antistoff per reaksjon. Tilsett 25,5 mikroliter av antistoffvaskbufferblandingen, etterfulgt av skånsom pipettering til hver prøve som behandles med et antistoff rettet mot proteinet av interesse. Inkuber i en time ved romtemperatur.Sett deretter prøvene tilbake på det 96-brønns magnetiske stativet. Når supernatanten er klar, fjern og kast den uten forstyrrende perler. Etter å ha fjernet platen fra magnetstativet, vask perlene med 100 mikroliter vaskebuffer og resuspend ved pipettering.Etter å ha plassert platen tilbake på et 96-brønns magnetisk stativ og kastet supernatant som vist tidligere, resuspend hver prøve i 25 mikroliter vaskebuffer. Lag et protein En MNase masterblanding ved å tilsette 25 mikroliter vaskebuffer og en optimalisert mengde protein A MNase per reaksjon. Tilsett 25 mikroliter protein A MNase masterblanding i hver prøve, inkludert kontrollprøvene.Inkuber prøvene i 30 minutter ved romtemperatur. Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ. La supernatanten fjerne i minst fem minutter og deretter fjerne og kaste supernatanten uten å forstyrre perlene.Etter å ha fjernet platen fra magnetstativet, vask perlene med 100 mikroliter vaskebuffer og resuspend ved skånsom pipettering. Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ og kast supernatanten som vist tidligere. Fjern deretter prøvene fra magnetstativet og resuspend perlene i 50 mikroliter vaskebuffer ved skånsom pipettering.Likevekt prøvene til null grader Celsius i en isvannblanding i fem minutter og fjern deretter prøvene fra isvannbadet. Tilsett en mikroliter 100 millimolar kalsiumklorid ved hjelp av en flerkanals pipette. Bland godt tre til fem ganger med skånsom pipettering ved hjelp av en flerkanals pipette med stort volum og returner deretter prøvene til null grader Celsius.Start en 10 minutters timer så snart platen er tilbake i isvannbadet. Stopp reaksjonen ved å pipettere 50 mikroliter av en løsning som inneholder dobbelt så stor konsentrasjon av RSTOP+, og buffer inn i hver brønn i samme rekkefølge som kalsiumkloridet ble tilsatt. Inkuber prøvene i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Snurr platen ved 16 000 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ. La supernatanten klare i minst fem minutter.Overfør deretter supernatanter til en frisk 96-brønnsplate og kast perlene. For DNA-ekstraksjon, tilsett en mikroliter på 10% SDS og 0,83 mikroliter på 20 milligram per milliliter proteinase K til hver prøve og bland prøvene ved skånsom pipettering. Inkuber prøvene i 10 minutter ved 70 grader Celsius.Sett platen tilbake til romtemperatur. Tilsett 46,6 mikroliter fem-molar natriumklorid og 90 mikroliter med 50% PEG4000 og bland ved skånsom pipettering. Tilsett 33 mikroliter polystyrenmagnetittperler til hver prøve og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.Plasser platen på et magnetisk stativ og la supernatanten tømmes i rundt fem minutter. Kast deretter forsiktig supernatanten uten å forstyrre perlene. Skyll to ganger med 150 mikroliter 80% etanol uten å forstyrre perlene.Snurr platen kort ved 1000 ganger G i 30 sekunder. Plasser platen tilbake på et 96-brønns magnetisk stativ og fjern alt gjenværende etanol uten å forstyrre perlene. Lufttørk prøvene i rundt to til fem minutter.Resuspend perlene i 37,5 mikroliter av 10-millimolar TRIS hydroklorid av pH 8 og inkubere i fem minutter ved romtemperatur. Plasser platen tilbake på et magnetisk stativ og la perlene binde seg i fem minutter. Overfør 36,5 mikroliter av supernatanten til en fersk termosyklerkompatibel 96-brønnsplate og kast perlene.Etter å ha utført cellekvalitetsvurdering ble celleutseende og prosentandel undersøkt, noe som viste at embryonale stamceller av lav kvalitet ikke bør brukes. Encellet sortering ble utført ved hjelp av Hoechst 33342 flekk, og testcellene ble telt for å sikre at enten null eller en celle finnes i hver brønn. Agarose gel analyse avdekket en lav molekylvekt stige og individuelle encellede uliCUT&RUN biblioteker.Suboptimal og optimal bibliotekanalyse viser en lavmolekylær vekt stige, suboptimalt bibliotek på grunn av ineffektiv Mnase fordøyelse, og vellykket bibliotek med passende fordøyelse. Fragmentanalysatordistribusjon viser at den forventede størrelsen på encellede områder varierer fra 150 til 500 basispar. Men i store proteiner vil DNA ha rundt 270 basepar.Protein belegg ved hjelp av single-locus genom nettleser som viser høyt cellenummer eller negativ kontroll og encellet CTCF uliCUT&RUN avslørte at encellede i stor grad representerte sterke topper, ligner høycellet uliCUT&RUN. Varmekart over encellet CTCF eller negativ kontroll avslørte et klart mønster av leseberikelse direkte over etablerte CTCF-bindingssteder i cellene. Endimensjonale varmekart viser en høyere lesetetthet over etablerte CTCF-bindingssteder i encellede biblioteker i forhold til omkringliggende regioner og ikke-antistoffkontroller, som demonstrerer antistoffspesifikk berikelse på etablerte bindingssteder.Likevekt av perlebundne kjerner på isvannbadet og ikke overoppheting av prøven ved kalsiumkloridtilsetning er viktig for å forhindre over fordøyelse av kromatinet.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enkelt Cell transcriptional Profilering av Adult Mouse cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Kromatin Immunoprecipitation (chip) ved hjelp Drosophila Vev

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Lokalisering Bruke Photo-aktivert Lokalisering Mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Effektiv Chromatin immunoprecipitation hjelp Begrense mengder biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generasjon av Plasmidvektorer Uttrykke FLAG-merket Proteiner Under forordning of Human Forlengelse Factor-1α Arrangøren Bruke Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering av Spesifikke Genomiske Regioner og Identifisering av Associated Molekyler av enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Anvendelser av Single-sonde: massespektrometri Imaging og enkelt celle analyse under omgivelses

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifisering av områdespesifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometri ved hjelp av Data-uavhengig oppkjøpet massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...