Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Мы благодарим членов Лаборатории Хайнера за чтение и комментарии к более ранней версии этой рукописи. Этот проект использовал NextSeq500, доступный в Университете Питтсбурга Health Sciences Sequencing Core в детской больнице UPMC в Питтсбурге для секвенирования с особой благодарностью его директору Уильяму Макдональду. Это исследование было частично поддержано Центром исследовательских вычислений Университета Питтсбурга через предоставленные компьютерные ресурсы. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Номер гранта R35GM133732 (S.J.H.).

Заявление по этике: Все исследования были одобрены Институциональным бюро по биобезопасности по охране научных исследований в Университете Питтсбурга.
1. Подготовьте магнитные шарики
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните перед сортировкой ячеек и держите на льд...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN является эффективным протоколом для определения локализации белка на хроматине. Он имеет много преимуществ по сравнению с другими протоколами, в том числе: 1) высокое отношение сигнал/шум, 2) быстрый протокол и 3) низкое покрытие секвенирования считывания, что приводит к экономии сре...

Многие ядерные белки функционируют, взаимодействуя с хроматином, чтобы стимулировать или предотвращать деятельность, основанную на шаблонах ДНК. Чтобы определить функцию этих хроматин-взаимодействующих белков, важно определить геномные места, в которых эти белки связаны. С момента своего развития в 1985 году иммунопреципитация хроматина (ChIP) была золотым стандартом для определения того, где белок связывается с хроматином 1,2. Традиционная техника ChIP имеет следующий базовый рабочий процесс: клетки собираются и сшиваются (обычно с формальдегидом), хроматин сдвигается (обычно с помощью жестких методов обработки ультразвуком, требующих сшивки), интересующий белок иммунопреципитируется с использованием антитела, которое нацелено на белок (или помеченный белок), за которым следует вторичное антитело (связанное с агарозой или магнитными шариками), сшивание обратное, белок и РНК перевариваются для очистки ДНК, и эта обогащенная ChIP ДНК используется в качестве шаблона для анализа (с использованием радиомаркированных зондов 1,2, qPCR3, микрочипов 5,6 или секвенирования4). С появлением микрочипов и массово параллельного глубокого секвенирования в последнее время были разработаны ChIP-чипы 5,6 и ChIP-seq 4, которые позволяют идентифицировать локализацию белка на хроматине в масштабах всего генома. Кросслинкинг ChIP был мощным и надежным методом с момента его появления с крупными достижениями в разрешении ChIP-exo7 и ChIP-nexus8. Параллельно с разработкой ChIP-seq были созданы нативные (не сшивающие) протоколы для ChIP (N-ChIP), которые используют сбраживание нуклеазы (часто с использованием микрококковой нуклеазы или МНазы) для фрагментации хроматина, в отличие от ультразвука, выполняемого в традиционных методах сшивания ChIP9. Тем не менее, одним из основных недостатков технологий как сшивки ChIP, так и N-ChIP было требование высокого количества клеток из-за низкого выхода ДНК после экспериментальной манипуляции. Поэтому в последние годы многие усилия были направлены на оптимизацию технологий ChIP для низкосотового ввода. Эти усилия привели к разработке многих мощных технологий на основе CHIP, которые различаются по своей применимости и входным требованиям 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Тем не менее, одноклеточные технологии на основе ChIP-seq отсутствовали, особенно для негистоновых белков.
В 2004 году была разработана альтернативная технология для определения занятости белка на хроматине, называемая эндогенным расщеплением хроматина (ChEC) и иммунодеказацией хроматина (ChIC)19. Эти методы с одним локусом используют слияние МНазы либо с интересующим белком (ChEC), либо с белком A (ChIC) для прямого разрезания ДНК, прилегающей к интересующему белку. В последние годы как ChEC, так и ChIC были оптимизированы для профилирования белка по всему геному на хроматине (ChEC-seq и CUT& RUN соответственно)20,21. Хотя ChEC-seq является мощным методом определения локализации факторов, он требует разработки белков слияния MNase для каждой мишени, тогда как ChIC и его вариация генома, CUT & RUN, полагаются на антитело, направленное на интересующий белок (как в случае с ChIP) и рекомбинантный белок A-MNase, где белок A может распознавать постоянную область антитела IgG. В качестве альтернативы был разработан слияние белка A/белка G-MNase (pA/G-MNase), которое может распознавать более широкий диапазон постоянныхобластей антител 22. CUT&RUN быстро стал популярной альтернативой ChIP-seq для определения локализации белка на хроматине по всему геному.
Сверхнизкий вход CUT&RUN (uliCUT&RUN), разновидность CUT&RUN, которая позволяет использовать низко- и одноэлементные входы, был описан в 2019 году23. Здесь описана методология ручного применения одной ячейки в формате 96 скважин. Важно отметить, что с момента разработки uliCUT&RUN были разработаны две альтернативы для профилирования гистонов, CUT&Tag и iACT-seq, обеспечивающие надежное и высокопараллельное профилирование гистоновых белков24,25. Кроме того, scCUT&Tag был оптимизирован для профилирования нескольких факторов в одной клетке (multiCUT&Tag) и для применения к негистоновым белкам26. Вместе CUT&RUN предоставляет привлекательную альтернативу низкому входному ChIP-seq, где uliCUT&RUN может быть выполнен в любой лаборатории молекулярной биологии, имеющей доступ к сортировщику клеток и стандартному оборудованию.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Определение мест связывания белка на хроматине имеет важное значение для понимания его функции и потенциальных регуляторных целей. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) была золотым стандартом для определения локализации белка в течение более 30 лет и определяется использованием антитела для извлечения интересующего белка из ультразвукового или ферментативно переваренного хроматина. Совсем недавно методы привязки антител стали популярными для оценки локализации белка на хроматине из-за их повышенной чувствительности. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT & RUN) является геномным производным иммуноочистения хроматина (ChIC) и использует рекомбинантный белок A, привязанный к микрококковой нуклеазе (pA-MNase), для идентификации постоянной области IgG антитела, нацеленного на интересующий белок, что позволяет сайт-специфическое расщепление ДНК, фланкирующее интересующий белок. CUT&RUN может использоваться для профилирования модификаций гистонов, факторов транскрипции и других хроматин-связывающих белков, таких как факторы ремоделирования нуклеосом. Важно отметить, что CUT&RUN может быть использован для оценки локализации эвхроматических или гетерохроматически-ассоциированных белков и модификаций гистонов. По этим причинам CUT&RUN является мощным методом определения профилей связывания широкого спектра белков. Недавно CUT&RUN был оптимизирован для профилирования транскрипционного фактора в низких популяциях клеток и отдельных клеток, а оптимизированный протокол был назван сверхнизким входным CUT&RUN (uliCUT&RUN). Здесь представлен подробный протокол для профилирования одноклеточного фактора с использованием uliCUT&RUN в ручном 96-луночном формате.

Здесь представлен подробный протокол профилирования одноклеточного белка на хроматине с использованием 96-луночного ручного формата uliCUT&RUN. Хотя результаты будут варьироваться в зависимости от профилируемого белка (из-за обилия белка и качества антител), типа клеток и других способств...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN и его варианты могут быть использованы для определения занятости белка на хроматине. Этот протокол описывает, как определить локализацию белка на хроматине с помощью одноклеточного uliCUT & RUN.

Локализация одноклеточного фактора на хроматине с использованием сверхнизкого входного расщепления под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN является мощным методом определения локализации белка на хроматине, и здесь мы описываем одноклеточную версию этой техники в ручном 96-луночном формате. Большинство методов локализации белка, таких как ChIP-seq, требуют высокой клеточной нагрузки и занимают примерно три дня. CUT&RUN, из-за высокого сигнала и низкого фона, был оптимизирован для применения с низкими и одноячечными ячейками и может быть завершен за один день.Мы предполагаем, что этот метод может быть применен практически к любому биологическому образцу и может быть особенно мощным для определения локализации факторов в редких образцах с низким содержанием, таких как драгоценные образцы пациентов. Прежде чем проводить какие-либо одноклеточные эксперименты, протестируйте антитела и технику на большом количестве недрагоценных клеток. Основным ограничением этого эксперимента является зависимость от крепкого антитела.Демонстрирует процедуру Сантана Лардо, опытный специалист-исследователь из моей лаборатории. После сортировки отдельных ячеек и связывания ядер с шариками поместите пластину из 96 лунок на магнитную стойку с 96 лунками и дайте шарикам связываться в течение как минимум пяти минут. Затем удалите и выбросьте супернатант.Добавьте 100 микролитров блокирующего буфера к шарикам, связанным с ядром, смешайте с мягким пипетированием и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками и дайте супернатанту очиститься в течение как минимум пяти минут. Затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.Снимите пластину с магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 100 микролитрах промывочного буфера за реакцию с мягким пипетированием. Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься, а затем извлеките и выбросьте супернатант. Повторное суспендирование шариков в 25 микролитров промывочного буфера за реакцию с щадящим пипетированием.Сделайте первичную смесь антител путем аликвотирования 25 микролитров промывочного буфера за реакцию, а затем добавьте 0,5 микролитра антитела за реакцию. Добавьте 25,5 микролитров буферной смеси антител с последующим мягким пипетированием к каждому образцу, обработанному антителом, нацеленным на интересующий белок. Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре.Затем снова поместите образцы обратно на магнитную стойку с 96 лунками. Как только супернатант очистится, удалите и выбросьте его, не беспокоя бусины. После снятия пластины с магнитной стойки вымойте бусины 100 микролитрами буфера для стирки и повторно суспендируйте пипеткой.После размещения пластины обратно на магнитной стойке с 96 лунками и сброса супернатанта, как показано ранее, повторно суспендируйте каждый образец в 25 микролитрах буфера промывки. Сделайте мастер-смесь белковой А МНазы, добавив 25 микролитров промывочного буфера и оптимизированное количество белка А МНазы за реакцию. Добавьте 25 микролитров главной смеси белка А МНазы к каждому образцу, включая контрольные образцы.Инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками. Дайте супернатанту очиститься в течение как минимум пяти минут, а затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.После снятия пластины с магнитной стойки вымойте бусины 100 микролитрами буфера для стирки и повторно суспендируйте мягким пипеткой. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками и выбросьте супернатант, как было показано ранее. Затем извлеките образцы из магнитной стойки и повторно суспендируйте бусины в 50 микролитрах буфера для стирки путем бережной пипетки.Уравновесьте образцы до нуля градусов Цельсия в ледяной водной смеси в течение пяти минут, а затем извлеките образцы из ледяной водяной бани. Добавьте один микролитр 100-миллимолярного хлорида кальция с помощью многоканальной пипетки. Хорошо перемешайте три-пять раз с мягкой пипеткой с использованием многоканальной пипетки большого объема, а затем верните образцы к нулю градусов Цельсия.Запустите 10-минутный таймер, как только тарелка вернется на ледяную водяную баню. Остановите реакцию путем пипетирования 50 микролитров раствора, содержащего вдвое большую концентрацию RSTOP+ и буфера, в каждую лунку в том же порядке, в котором добавляли хлорид кальция. Инкубируйте образцы в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия.Вращайте пластину в 16 000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками. Дайте супернатанту очиститься в течение как минимум пяти минут.Затем переложите супернатанты на свежую 96-луночную тарелку и выбросьте бусины. Для экстракции ДНК добавьте один микролитр 10% SDS и 0,83 микролитра 20 миллиграммов на миллилитр протеиназы K к каждому образцу и перемешайте образцы путем бережного пипетирования. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при температуре 70 градусов Цельсия.Верните пластину к комнатной температуре. Добавьте 46,6 микролитров пятимолярного хлорида натрия и 90 микролитров 50% ПЭГ4000 и перемешайте путем бережного пипетирования. Добавьте 33 микролитра полистирольных магнетитовых шариков в каждый образец и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.Поместите пластину на магнитную стойку и дайте супернатанту очиститься в течение примерно пяти минут. Затем осторожно выбросьте супернатант, не потревожив бусины. Промыть дважды 150 микролитрами 80% этанола, не нарушая бусины.Вращайте пластину ненадолго в 1000 раз G в течение 30 секунд. Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками и удалите весь остаточный этанол, не нарушая бусины. Высушите образцы на воздухе в течение двух-пяти минут.Повторно суспендируют шарики в 37,5 микролитрах 10-миллимолярного гидрохлорида TRIS рН 8 и инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите пластину обратно на магнитную стойку и дайте бусинам скрепиться в течение пяти минут. Переложите 36,5 микролитров супернатанта на свежую термоциклер-совместимую 96-луночную пластину и выбросьте бусины.После проведения оценки качества клеток был изучен внешний вид и процентное содержание клеток, демонстрируя, что не следует использовать низкокачественные эмбриональные стволовые клетки. Одноклеточную сортировку проводили с использованием окрашивания Hoechst 33342, и испытуемые ячейки были подсчитаны, чтобы гарантировать, что в каждой скважине обнаружена либо нулевая, либо одна клетка. Анализ агарозного геля выявил низкомолекулярную лестницу и отдельные одноклеточные библиотеки uliCUT&RUN.Неоптимальный и оптимальный библиотечный анализ показывает низкомолекулярную лестницу, неоптимальную библиотеку из-за неэффективного переваривания Mnase и успешную библиотеку с соответствующим пищеварением. Распределение анализатора фрагментов показывает, что ожидаемый размер одноячеистой ячейки колеблется от 150 до 500 пар оснований. Однако в крупных белках ДНК будет иметь около 270 пар оснований.Заполненность белка с использованием однолокусного браузера генома, изображающего высокое количество клеток или отрицательный контроль, и одноклеточный CTCF uliCUT & RUN показал, что одноклеточные в значительной степени представляют собой сильные пики, похожие на высококлеточные uliCUT & RUN. Тепловые карты одноклеточных CTCF или отрицательного контроля выявили четкую картину обогащения чтения непосредственно над установленными сайтами связывания CTCF в клетках. Одномерные тепловые карты показывают более высокую плотность считывания по сравнению с установленными сайтами связывания CTCF в одноклеточных библиотеках по сравнению с окружающими областями и контролем без антител, демонстрируя обогащение антителами в установленных местах связывания.Уравновешивание связанных шариками ядер на ледяной водяной бане и не перегрев образца при добавлении хлорида кальция важно для предотвращения переваривания хроматина.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell транскрипции Профилирование взрослых кардиомиоцитов мышь

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Хроматин иммунопреципитации (чип) использование Drosophila Ткани

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Эффективное использование Иммунопреципитация хроматина Ограничение количество биомассы

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Генерация плазмидных векторов выражая флага меченных белков соответствии с Положением удлинения Человеческий фактор-1α промотора, используя Gibson Ассамблею

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Применения с одним зондом: Масс-спектрометрия и цифровой обработки изображений Single Cell Анализ в условиях окружающей среды

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Количественная оценка конкретных участков белка лизин ацетилирования и стехиометрии Succinylation с помощью приобретения данных независимые масс-спектрометрия

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...