Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Vi tackar medlemmar av Hainer Lab för att ha läst och kommenterat en tidigare version av detta manuskript. Detta projekt använde NextSeq500 som finns tillgänglig vid University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core vid UPMC Children's Hospital of Pittsburgh för sekvensering med särskilt tack till dess chef, William MacDonald. Denna forskning stöddes delvis av University of Pittsburgh Center for Research Computing genom de datorresurser som tillhandahålls. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (till S.J.H.).

Etiskt uttalande: Alla studier godkändes av Institutional Biosafety Office of Research Protections vid University of Pittsburgh.
1. Förbered magnetiska pärlor
OBS: Utför före cellsortering och håll isen tills den används.
<ol><li>Pipett 30 μL ConA-konjugerad paramagnetisk mikrosfär pärlslamblandning per reaktion på ett nytt 1,5 ml mikrofugerör och tillsätt 850 μL bindningsbuffert, pipettering försiktigt för att blanda. OBS: KonA...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT &RUN är ett effektivt protokoll för att bestämma proteinlokalisering på kromatin. Det har många fördelar jämfört med andra protokoll, inklusive: 1) högt signal-brusförhållande, 2) snabbt protokoll och 3) låg sekvenseringstäckning som krävs, vilket leder till kostnadsbesparingar. Användningen av protein A- eller protein A/G-MNas gör det möjligt att applicera CUT&RUN med alla tillgängliga antikroppar; därför har den potential att snabbt och enkelt profilera många proteiner. Anpassning till encellig...

Många nukleära proteiner fungerar genom att interagera med kromatin för att främja eller förhindra DNA-mallade aktiviteter. För att bestämma funktionen hos dessa kromatin-interagerande proteiner är det viktigt att identifiera de genomiska platserna vid vilka dessa proteiner är bundna. Sedan dess utveckling 1985 har kromatinimmunutfällning (ChIP) varit guldstandarden för att identifiera var ett protein binder till kromatin 1,2. Den traditionella ChIP-tekniken har följande grundläggande arbetsflöde: celler skördas och tvärlänkas (vanligtvis med formaldehyd), kromatin skjuvas (vanligtvis med hårda ultraljudsbehandlingsmetoder, vilket kräver tvärbindning), proteinet av intresse är immunutfällt med hjälp av en antikropp som riktar sig mot proteinet (eller märkt protein) följt av en sekundär antikropp (kopplad till agaros eller magnetiska pärlor), tvärbindning vänds, protein och RNA smälts för att rena DNA, och detta ChIP-berikade DNA används som mall för analys (med hjälp av radioaktivt märkta sonder 1,2, qPCR3, mikroarrays 5,6 eller sekvensering4). Med tillkomsten av mikroarrayer och massivt parallell djupsekvensering har ChIP-chip 5,6 och ChIP-seq4 nyligen utvecklats och möjliggör genomomfattande identifiering av proteinlokalisering på kromatin. Tvärbindning ChIP har varit en kraftfull och pålitlig teknik sedan dess tillkomst med stora framsteg i upplösning av ChIP-exo7 och ChIP-nexus8. Parallellt med utvecklingen av ChIP-seq, native (non-crosslinking) protokoll för ChIP (N-ChIP) har upprättats, som använder nukleas matsmältning (ofta med hjälp av mikrokocknukleas eller MNase) för att fragmentera kromatinet, i motsats till ultraljudsbehandling utförs i traditionella tvärbindning ChIP tekniker9. En stor nackdel med både tvärbindning av ChIP- och N-ChIP-teknik har dock varit kravet på höga celltal på grund av lågt DNA-utbyte efter experimentell manipulation. Därför har många ansträngningar under senare år varit för att optimera ChIP-teknik för låg cellinmatning. Dessa ansträngningar har resulterat i utvecklingen av många kraftfulla ChIP-baserade tekniker som varierar i tillämplighet och ingångskrav 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Emellertid har encellig ChIP-seq-baserad teknik saknats, särskilt för icke-histonproteiner.
År 2004 utvecklades en alternativ teknik för att bestämma proteinbeläggningen på kromatin benämnt kromatin endogen klyvning (ChEC) och kromatinimmunskläckning (ChIC)19. Dessa single-locus-tekniker använder en fusion av MNase till antingen proteinet av intresse (ChEC) eller till protein A (ChIC) för direkt skärning av DNA intill proteinet av intresse. På senare år har både ChEC och ChIC optimerats för genomomfattande proteinprofilering på kromatin (ChEC-seq respektive CUT&RUN)20,21. Medan ChEC-seq är en kraftfull teknik för att bestämma faktorlokalisering, kräver det att man utvecklar MNase-fusionsproteiner för varje mål, medan ChIC och dess genomomfattande variation, CUT & RUN, förlitar sig på en antikropp riktad mot proteinet av intresse (som med ChIP) och rekombinant protein A-MNase, där proteinet A kan känna igen IgG-konstantområdet i antikroppen. Som ett alternativ har ett fusionsprotein A/protein G-MNas (pA/G-MNase) utvecklats som kan känna igen ett bredare spektrum av antikroppskonstanta regioner22. CUT&RUN har snabbt blivit ett populärt alternativ till ChIP-seq för att bestämma proteinlokalisering på kromatingenomet.
Ultralåg ingång CUT&RUN (uliCUT&RUN), en variant av CUT&RUN som möjliggör användning av låg- och encellsingångar, beskrevs 201923. Här beskrivs metoden för en manuell 96-brunnsformat encellsapplikation. Det är viktigt att notera att sedan utvecklingen av uliCUT&RUN har två alternativ för histonprofilering, CUT&Tag och iACT-seq utvecklats, vilket ger robust och mycket parallell profilering av histonproteiner24,25. Dessutom har scCUT&Tag optimerats för profilering av flera faktorer i en enda cell (multiCUT&Tag) och för applicering på icke-histonproteiner26. Tillsammans erbjuder CUT&RUN ett attraktivt alternativ till ChIP-seq med låg ingång där uliCUT&RUN kan utföras i alla molekylärbiologiska laboratorier som har tillgång till en cellsorterare och standardutrustning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Att bestämma bindningsplatserna för ett protein på kromatin är avgörande för att förstå dess funktion och potentiella regleringsmål. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) har varit guldstandarden för att bestämma proteinlokalisering i över 30 år och definieras av användningen av en antikropp för att dra ut proteinet av intresse från sonicated eller enzymatiskt smält kromatin. På senare tid har antikroppsdelningstekniker blivit populära för att bedöma proteinlokalisering på kromatin på grund av deras ökade känslighet. Klyvning under targets & release under nukleas (CUT &RUN) är det genomomfattande derivatet av kromatinimmunavage (ChIC) och använder rekombinant protein A bunden till mikrokocknukleas (pA-MNas) för att identifiera IgG-konstantregionen för antikroppen som riktar sig mot ett protein av intresse, vilket möjliggör platsspecifik klyvning av DNA som flankerar proteinet av intresse. CUT & RUN kan användas för att profilera histonmodifieringar, transkriptionsfaktorer och andra kromatinbindande proteiner såsom nukleosommodelleringsfaktorer. Viktigt är att CUT &RUN kan användas för att bedöma lokaliseringen av antingen eukromatiska eller heterokromatiskt associerade proteiner och histonmodifieringar. Av dessa skäl är CUT &RUN en kraftfull metod för att bestämma bindningsprofilerna för ett brett spektrum av proteiner. Nyligen har CUT&RUN optimerats för transkriptionsfaktorprofilering i låga populationer av celler och enskilda celler och det optimerade protokollet har kallats ultralåg input CUT&RUN (uliCUT&RUN). Här presenteras ett detaljerat protokoll för encellsfaktorprofilering med uliCUT&RUN i ett manuellt 96-brunnsformat.

Här presenteras ett detaljerat protokoll för encellsproteinprofilering på kromatin med ett 96-brunns manuellt format uliCUT&RUN. Medan resultaten kommer att variera beroende på proteinet som profileras (på grund av proteinöverflöd och antikroppskvalitet), celltyp och andra bidragande faktorer, diskuteras förväntade resultat för denna teknik här. Cellkvalitet (cellutseende och procent av viabla celler) och encellssortering bör bedömas före eller vid tidpunkten för levande cellsortering i NE-bufferten. Ett e...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN och dess varianter kan användas för att bestämma proteinbeläggning på kromatin. Detta protokoll beskriver hur man bestämmer proteinlokalisering på kromatin med hjälp av encelliga uliCUT &RUN.

Enkelcellsfaktorlokalisering på kromatin med ultralåg ingångsklyvning under mål och frisättning med nukleas

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN är en kraftfull teknik för att bestämma proteinlokalisering på kromatin, och här beskriver vi en encellsversion av denna teknik i ett manuellt 96-brunnsformat. De flesta proteinlokaliseringstekniker, som ChIP-seq, kräver hög cellinmatning och tar ungefär tre dagar att slutföra. CUT & RUN, på grund av den höga signalen och den låga bakgrunden, har optimerats för lågcells- och encellsapplikation och kan slutföras på en enda dag.Vi föreställer oss att denna teknik kan tillämpas på nästan alla biologiska prover och kan vara särskilt kraftfull för att bestämma faktorlokalisering i sällsynta och lågöverflödsprover, såsom värdefulla patientprover. Innan du utför några encelliga experiment, testa antikroppen och tekniken på ett stort antal icke-värdefulla celler. Huvudbegränsningen för detta experiment är beroendet av en robust antikropp.Demonstrerar proceduren är Santana Lardo, en erfaren forskningsspecialist från mitt laboratorium. Efter att ha sorterat enskilda celler och bundit kärnor till pärlor, placera 96-brunnsplattan på ett 96-brunns magnetställ och låt pärlorna binda i minst fem minuter. Ta sedan bort och kassera supernatanten.Tillsätt 100 mikroliter blockerande buffert till de kärnbundna pärlorna, blanda med mild pipettering och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur. Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ och låt supernatanten rensa i minst fem minuter. Ta sedan bort och kassera supernatanten utan att störa pärlorna.Ta bort plattan från magnetstället och återsuspendera pärlorna i 100 mikroliter tvättbuffert per reaktion med mild pipettering. Placera plattan tillbaka på 96-brunnsmagnetstället, låt supernatanten rensa och ta sedan bort och kassera supernatanten. Resuspend pärlorna i 25 mikroliter tvättbuffert per reaktion med mild pipettering.Gör en primär antikroppsblandning genom att alicitera 25 mikroliter tvättbuffert per reaktion och tillsätt sedan 0,5 mikroliter antikropp per reaktion. Tillsätt 25,5 mikroliter av antikroppstvättbuffertblandningen, följt av skonsam pipettering till varje prov som behandlas med en antikropp riktad mot proteinet av intresse. Inkubera i en timme vid rumstemperatur.Placera sedan proverna igen på magnetstället med 96 brunnar. När supernatanten är klar, ta bort och kassera den utan att störa pärlor. När du har tagit bort plattan från magnetstället, tvätta pärlorna med 100 mikroliter tvättbuffert och återsuspendera genom pipettering.Efter att ha placerat tillbaka plattan på ett 96-brunns magnetställ och kasserat supernatant som visats tidigare, återsuspendera varje prov i 25 mikroliter tvättbuffert. Gör ett protein A MNase masterblandning genom att tillsätta 25 mikroliter tvättbuffert och en optimerad mängd protein A MNase per reaktion. Tillsätt 25 mikroliter protein A MNase-masterblandning till varje prov, inklusive kontrollproverna.Inkubera proverna i 30 minuter vid rumstemperatur. Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ. Låt supernatanten rensa i minst fem minuter och ta sedan bort och kasta supernatanten utan att störa pärlorna.När du har tagit bort plattan från magnetstället, tvätta pärlorna med 100 mikroliter tvättbuffert och återsuspendera genom mild pipettering. Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ och kassera supernatanten som visats tidigare. Ta sedan bort proverna från magnetstället och återsuspendera pärlorna i 50 mikroliter tvättbuffert genom mild pipettering.Balansera proverna till noll grader Celsius i en isvattenblandning i fem minuter och ta sedan bort proverna från isvattenbadet. Tillsätt en mikroliter 100 millimolär kalciumklorid med en flerkanalig pipett. Blanda väl tre till fem gånger med mild pipettering med en flerkanalig pipett med stor volym och sätt sedan tillbaka proverna till noll grader Celsius.Starta en 10 minuters timer så snart plattan är tillbaka i isvattenbadet. Stoppa reaktionen genom att pipettera 50 mikroliter av en lösning innehållande dubbelt så hög koncentration av RSTOP+ och buffert i varje brunn i samma ordning som kalciumkloriden tillsattes. Inkubera proverna i 20 minuter vid 37 grader Celsius.Snurra plattan vid 16 000 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ. Låt supernatanten rensa i minst fem minuter.Överför sedan supernatanter till en ny 96-brunnsplatta och kasta pärlorna. För DNA-extraktion, tillsätt en mikroliter 10% SDS och 0,83 mikroliter 20 milligram per milliliter proteinas K till varje prov och blanda proverna genom mild pipettering. Inkubera proverna i 10 minuter vid 70 grader Celsius.Sätt tillbaka plattan till rumstemperatur. Tillsätt 46,6 mikroliter femmolär natriumklorid och 90 mikroliter 50% PEG4000 och blanda med mild pipettering. Tillsätt 33 mikroliter polystyrenmagnetitpärlor till varje prov och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.Placera plattan på ett magnetställ och låt supernatanten rensa i cirka fem minuter. Kasta sedan försiktigt supernatanten utan att störa pärlorna. Skölj två gånger med 150 mikroliter 80% etanol utan att störa pärlorna.Snurra plattan kort vid 1000 gånger G i 30 sekunder. Placera tillbaka plattan på ett 96-brunns magnetställ och ta bort all kvarvarande etanol utan att störa pärlorna. Lufttorka proverna i cirka två till fem minuter.Resuspend pärlorna i 37,5 mikroliter 10-millimolär TRIS-hydroklorid med pH 8 och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur. Lägg tillbaka plattan på ett magnetställ och låt pärlorna binda i fem minuter. Överför 36,5 mikroliter av supernatanten till en ny termocykelkompatibel 96-brunnsplatta och kasta pärlorna.Efter att ha utfört cellkvalitetsbedömning undersöktes cellens utseende och procentandel, vilket visade att embryonala stamceller av låg kvalitet inte skulle användas. Encellssortering utfördes med Hoechst 33342-fläck, och testcellerna räknades för att säkerställa att antingen noll eller en cell finns i varje brunn. Agarosgelanalys avslöjade en stege med låg molekylvikt och individuella encelliga uliCUT &RUN-bibliotek.Suboptimal och optimal biblioteksanalys visar en lågmolekylär viktstege, suboptimalt bibliotek på grund av ineffektiv Mnase-matsmältning och framgångsrikt bibliotek med lämplig matsmältning. Fragmentanalysatorfördelning visar att den förväntade storleken på encellsintervall från 150 till 500 baspar. Men i stora proteiner kommer DNA att ha cirka 270 baspar.Proteinbeläggning med hjälp av en-locus genomwebbläsare som visar högt cellantal eller negativ kontroll och encellig CTCF uliCUT & RUN avslöjade att encell i stor utsträckning representerade starka toppar, liknande högcelliga uliCUT & RUN. Värmekartor över encellig CTCF eller negativ kontroll avslöjade ett tydligt mönster av läsanrikning direkt över etablerade CTCF-bindningsställen i cellerna. Endimensionella värmekartor visar en högre läsdensitet över etablerade CTCF-bindningsställen i encellsbibliotek i förhållande till omgivande regioner och icke-antikroppskontroller, vilket visar antikroppsspecifik anrikning vid etablerade bindningsställen.Att balansera de pärlbundna kärnorna på isvattenbadet och inte överhetta provet vid tillsats av kalciumklorid är viktigt för att förhindra översmältning av kromatinet.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomvid Analys med hjälp av chip för att identifiera isoform-specifik gen mål

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionell Profilering av Vuxen mus Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Kromatin Immunoutfällning (chip) med användning av Drosophila Vävnad

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: proteinlokalisering Använda Photo-aktiverad lokalisering Mikroskopi och elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Effektiv Kromatin Immunoprecipitation med begränsande mängder av biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation av plasmid vektorer som uttrycker FLAG-taggade proteiner Enligt förordningen om Human Förlängning Factor-1α Promoter Använda Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering av specifika genomregioner och Identifiering av associerade molekyler av enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Tillämpningar av Single-sonden: masspektrometri Imaging och Single cellanalys under normala förhållanden

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifiering av platsspecifika Protein lysin acetylering och Succinylation stökiometri använder Data-oberoende förvärv masspektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...