Name: single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Hainer Lab üyelerine bu makalenin önceki bir versiyonunu okudukları ve yorumladıkları için teşekkür ederiz. Bu proje, Pittsburgh Üniversitesi Sağlık Bilimleri Sıralama Çekirdeği'nde bulunan NextSeq500'ü, Pittsburgh Çocuk Hastanesi'ndeki UPMC Çocuk Hastanesi'nde, direktörü William MacDonald'a özel teşekkürlerle sıralamak için kullandı. Bu araştırma kısmen Pittsburgh Üniversitesi Araştırma Hesaplama Merkezi tarafından sağlanan bilgisayar kaynakları aracılığıyla desteklenmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe Numarası R35GM133732 (S.J.H.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Etik beyanı: Tüm çalışmalar Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Araştırma Koruma Ofisi tarafından onaylanmıştır.
1. Manyetik boncuklar hazırlayın
NOT: Hücre sıralamadan önce gerçekleştirin ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
<ol><li>Pipet 30 μL ConA-konjuge paramanyetik mikrosferler boncuk bulamaç karışımı taze 1,5 mL mikrofuge tüpe reaksiyon başına ve karıştırmak için hafifçe pipetleme yaparak 850 ?...

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation.">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li><li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li><li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III,+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region.">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells.">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li><li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-tube+linear+DNA+amplification+(LinDA)+for+robust+ChIP-seq.">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li><li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples.">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232 (2013).</li><li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cChIP-seq:+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications.">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083 (2015).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChlC+and+ChEC;+genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Hainer, S. J., Bo&#353;kovi&#263;, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos.">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+(ACT-seq).">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).</li><li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells.">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li><li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT&amp;RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts.">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&amp;RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li><li>Zheng, X. -. Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT&amp;RUN.">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&amp;RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li></ol>

CUT&RUN, kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu belirlemek için etkili bir protokoldür. Diğer protokollere göre birçok avantajı vardır: 1) yüksek sinyal-gürültü oranı, 2) hızlı protokol ve 3) düşük sıralama okuma kapsamı gerekli ve böylece maliyet tasarrufuna yol açar. Protein A- veya Protein A/G-MNaz kullanımı, CUT&RUN'un mevcut herhangi bir antikor ile uygulanmasını sağlar; bu nedenle, birçok proteinin profilini hızlı ve kolay bir şekilde çıkarma potansiyeline sahiptir. Bununla bir...

Birçok nükleer protein, DNA şablonlu aktiviteleri teşvik etmek veya önlemek için kromatin ile etkileşime girerek işlev görür. Bu kromatin etkileşiminde bulunan proteinlerin işlevini belirlemek için, bu proteinlerin bağlandığı genomik yerleri tanımlamak önemlidir. 1985 yılında geliştirilmesinden bu yana, Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), bir proteinin kromatin 1,2'ye nerede bağlandığını belirlemek için altın standart olmuştur. Geleneksel ChIP tekniği aşağıdaki temel iş akışına sahiptir: hücreler toplanır ve çapraz bağlanır (genellikle formaldehit ile), kromatin kesilir (genellikle çapraz bağlama gerektiren sert sonikasyon yöntemleriyle), ilgilenilen protein, proteini (veya etiketli proteini) hedef alan bir antikor kullanılarak immünopreprepite edilir, ardından ikincil bir antikor (agaroz veya manyetik boncuklara bağlanmış), çapraz bağlama tersine çevrilir, DNA'yı saflaştırmak için protein ve RNA sindirilir ve bu ChIP ile zenginleştirilmiş DNA, analiz için şablon olarak kullanılır (radyoetiketli problar1,2, qPCR3, mikrodiziler 5,6 veya dizileme4 kullanılarak). Mikrodizilerin ortaya çıkması ve büyük ölçüde paralel derin dizilemeyle birlikte, ChIP-çip 5,6 ve ChIP-seq4 daha yakın zamanda geliştirilmiştir ve kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun genom çapında tanımlanmasına izin vermektedir. ChIP'yi çapraz bağlamak, ChIP-exo7 ve ChIP-nexus8 tarafından çözünürlükte büyük ilerlemelerle ortaya çıkmasından bu yana güçlü ve güvenilir bir teknik olmuştur. ChIP-seq'in geliştirilmesine paralel olarak, geleneksel çapraz bağlama ChIP tekniklerinde gerçekleştirilen sonikasyonun aksine, kromatini parçalamak için nükleaz sindirimini (genellikle mikrokokal nükleaz veya MNaz kullanarak) kullanan ChIP (N-ChIP) için doğal (çapraz bağlanmayan) protokoller kurulmuştur9. Bununla birlikte, hem çapraz bağlanma ChIP hem de N-ChIP teknolojilerinin en büyük dezavantajlarından biri, deneysel manipülasyonu takiben düşük DNA verimi nedeniyle yüksek hücre sayılarına duyulan gereksinim olmuştur. Bu nedenle, son yıllarda, ChIP teknolojilerini düşük hücre girişi için optimize etmeye yönelik birçok çaba sarf edilmiştir. Bu çabalar, uygulanabilirlikleri ve girdi gereksinimleri10,11,12,13,14,15,16,17,18 olarak değişen birçok güçlü ChIP tabanlı teknolojinin geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, tek hücreli ChIP-seq tabanlı teknolojiler, özellikle histon olmayan proteinler için eksiktir.
2004 yılında, Kromatin Endojen Bölünme (ChEC) ve Kromatin İmmün Kemebölünme (ChIC)19 olarak adlandırılan kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için alternatif bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu tek lokus teknikleri, ilgilenilen proteine bitişik DNA'nın doğrudan kesilmesi için MNaz'ın ilgilenilen proteine (ChEC) veya protein A'ya (ChIC) füzyonunu kullanır. Daha yakın yıllarda, hem ChEC hem de ChIC, kromatin (sırasıyla ChEC-seq ve CUT&RUN) üzerinde genom çapında protein profillemesi için optimize edilmiştir 20,21. ChEC-seq, faktör lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir teknik olsa da, her hedef için MNaz-füzyon proteinlerinin geliştirilmesini gerektirirken, ChIC ve genom çapındaki varyasyonu CUT&RUN, ilgilenilen proteine (ChIP'de olduğu gibi) ve Protein A'nın antikorun IgG sabit bölgesini tanıyabildiği rekombinant Protein A-MNaz'a yönelik bir antikora güvenir. Alternatif olarak, daha geniş bir yelpazedeki antikor sabit bölgelerini tanıyabilen bir füzyon Protein A / Protein G-MNaz (pA / G-MNaz) geliştirilmiştir22. CUT&RUN, kromatin genomu genelinde protein lokalizasyonunu belirlemek için hızla ChIP-seq'e popüler bir alternatif haline gelmiştir.
Düşük ve tek hücreli girişlerin kullanılmasını sağlayan bir CUT&RUN varyasyonu olan ultra düşük girişli CUT&RUN (ULICUT&RUN), 201923 yılında açıklanmıştır. Burada, manuel 96 delikli formatta tek hücreli bir uygulamanın metodolojisi açıklanmaktadır. uliCUT&RUN'un geliştirilmesinden bu yana, histon profillemesi için iki alternatifin, CUT&Tag ve iACT-seq'in geliştirildiğini ve histon proteinlerinin sağlam ve oldukça paralel profillenmesini sağladığını belirtmek önemlidir24,25. Ayrıca, scCUT&Tag, tek bir hücrede (multiCUT&Tag) birden fazla faktörün profilini çıkarmak ve histon olmayan proteinlere uygulama için optimize edilmiştir26. Birlikte, CUT&RUN, uliCUT&RUN'un bir hücre ayıklayıcıya ve standart ekipmana erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebildiği düşük girişli ChIP-seq'e çekici bir alternatif sunar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL clear microfuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm sterile tissue culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 DNA Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X quick ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>5X high fidelity PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027 or 12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody to protein of interest</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-10</td>
			<td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62905AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD FACSAria II cell sorter</td>
			<td></td>
			<td>Requires training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-specific media for cell culture</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA spin columns</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>1920-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis equipment</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid&#160; (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with temperature and atmosphere control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7958889001</td>
			<td>hotstart high fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Bakery Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette set</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Adaptor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6612AVIAL</td>
			<td>Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Universal primer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6611AVIAL</td>
			<td>Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td>
			<td>Indexed Primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15593049</td>
			<td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phsophate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td># 4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A16151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA/G-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016</td>
			<td>pA/G-MNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>86973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate&#160; (NaOAc)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Inverted Light Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11526213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab agarose gel materials</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips</td>
			<td>Varies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td>Alternatively, can use a waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease

Bir proteinin kromatin üzerindeki bağlanma yerlerinin belirlenmesi, işlevini ve potansiyel düzenleyici hedeflerini anlamak için gereklidir. Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), 30 yılı aşkın bir süredir protein lokalizasyonunu belirlemek için altın standart olmuştur ve ilgilenilen proteini sonikleştirilmiş veya enzimatik olarak sindirilmiş kromatinden çıkarmak için bir antikor kullanımı ile tanımlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, antikor bağlama teknikleri, artan duyarlılıkları nedeniyle kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu değerlendirmek için popüler hale gelmiştir. Nükleaz Altında Hedefler Altında Bölünme ve Salınım (CUT&RUN), Kromatin İmmünoklevajının (ChIC) genom çapında türevidir ve ilgilenilen bir proteini hedefleyen antikorun IgG sabit bölgesini tanımlamak için mikrokokal nükleaza (pA-MNase) bağlı rekombinant Protein A'yı kullanır, bu nedenle ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın bölgeye özgü bölünmesini sağlar. CUT&RUN, histon modifikasyonlarını, transkripsiyon faktörlerini ve nükleozom yeniden şekillendirme faktörleri gibi diğer kromatin bağlayıcı proteinleri profillemek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, CUT&RUN, ökromatik veya heterokromatik ilişkili proteinlerin ve histon modifikasyonlarının lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenlerden dolayı, CUT&RUN çok çeşitli proteinlerin bağlanma profillerini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Son zamanlarda, CUT&RUN, düşük hücre popülasyonlarında ve tek hücrelerde transkripsiyon faktörü profillemesi için optimize edilmiştir ve optimize edilmiş protokol ultra düşük girişli CUT&RUN (uliCUT&RUN) olarak adlandırılmıştır. Burada, uliCUT & RUN kullanılarak manuel 96 kuyucuklu bir biçimde tek hücreli faktör profili oluşturma için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Burada, 96 kuyucuklu manuel bir format uliCUT & RUN kullanılarak kromatin üzerinde tek hücreli protein profillemesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Sonuçlar, profillenen proteine (protein bolluğu ve antikor kalitesi nedeniyle), hücre tipine ve diğer katkıda bulunan faktörlere bağlı olarak değişmekle birlikte, bu teknik için beklenen sonuçlar burada tartışılmaktadır. Hücre kalitesi (hücre görünümü ve canlı hücrelerin yüzdesi) ve tek hücreli sıralama, NE tamponuna canlı hücre...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease at JoVE.com

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

CUT&RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN, kromatin üzerinde protein lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir tekniktir ve burada bu tekniğin tek hücreli bir versiyonunu manuel 96 kuyucuklu bir biçimde açıklıyoruz. ChIP-seq gibi çoğu protein lokalizasyon tekniği, yüksek hücre girişi gerektirir ve tamamlanması yaklaşık üç gün sürer. CUT&RUN, yüksek sinyal ve düşük arka plan nedeniyle, düşük hücreli ve tek hücreli uygulama için optimize edilmiştir ve tek bir günde tamamlanabilir.Bu tekniğin hemen hemen her biyolojik örneğe uygulanabileceğini ve değerli hasta örnekleri gibi nadir ve düşük bolluktaki örneklerde faktör lokalizasyonunu belirlemek için özellikle güçlü olabileceğini öngörüyoruz. Herhangi bir tek hücreli deney yapmadan önce, antikoru ve tekniği çok sayıda değerli olmayan hücre üzerinde test edin. Bu deneyin ana sınırlaması, sağlam bir antikora bağımlılıktır.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan deneyimli bir araştırma uzmanı olan Santana Lardo. Tek hücreleri ayırdıktan ve çekirdekleri boncuklara bağladıktan sonra, 96 delikli plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların en az beş dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve atın.Çekirdeğe bağlı boncuklara 100 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin, nazik pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlenmesine izin verin. Ardından, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları reaksiyon başına 100 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin, süpernatantın temizlenmesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın. Boncukları, reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.Reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponu alarak birincil bir antikor ana karışımı yapın ve ardından reaksiyon başına 0.5 mikrolitre antikor ekleyin. 25,5 mikrolitre antikor yıkama tamponu karışımı ekleyin, ardından ilgilenilen proteini hedefleyen bir antikor ile muamele edilen her numuneye nazik pipetleme yapın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, numuneleri tekrar 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatant temizlendikten sonra, boncukları rahatsız etmeden çıkarın ve atın. Plakayı manyetik raftan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın ve pipetle indirerek tekrar askıya alın.Plakayı 96 delikli bir manyetik rafa geri yerleştirdikten ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı attıktan sonra, her numuneyi 25 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponu ve optimize edilmiş miktarda protein A MNaz ekleyerek bir protein A MNaz ana karışımı yapın. Kontrol numuneleri de dahil olmak üzere her numuneye 25 mikrolitre protein A MNase ana karışımı ekleyin.Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Plakayı 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.Plakayı manyetik raftan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın ve nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın. Ardından, numuneleri manyetik raftan çıkarın ve boncukları 50 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.Numuneleri beş dakika boyunca buzlu su karışımında sıfır santigrat dereceye dengeleyin ve ardından numuneleri buzlu su banyosundan çıkarın. Çok kanallı pipet kullanarak bir mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür ekleyin. Büyük hacimli çok kanallı pipet kullanarak nazik pipetleme ile üç ila beş kez iyice karıştırın ve ardından numuneleri sıfır santigrat dereceye geri döndürün.Plaka buzlu su banyosuna geri döner dönmez 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. RSTOP+ ve tampon konsantrasyonunun iki katını içeren bir çözeltinin 50 mikrolitresini, kalsiyum klorür eklendiği sırada her bir kuyucuğa pipetleyerek reaksiyonu durdurun. Numuneleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.Plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 16.000 kez G'de döndürün. Plakayı 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlemesine izin verin.Ardından, süpernatantları taze bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve boncukları atın. DNA ekstraksiyonu için, her numuneye bir mikrolitre% 10 SDS ve mililitre proteinaz K başına 0.83 mikrolitre 20 miligram ekleyin ve örnekleri nazik pipetleme ile karıştırın. Numuneleri 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin.Plakayı oda sıcaklığına geri getirin. 46.6 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 90 mikrolitre% 50 PEG4000 ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın. Her numuneye 33 mikrolitre polistiren manyetit boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın yaklaşık beş dakika boyunca temizlenmesine izin verin. Ardından, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Boncukları rahatsız etmeden 150 mikrolitre% 80 etanol ile iki kez durulayın.Plakayı 30 saniye boyunca 1000 kez G'de kısaca döndürün. Plakayı tekrar 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden tüm artık etanolleri çıkarın. Numuneleri yaklaşık iki ila beş dakika boyunca hava ile kurutun.Boncukları pH 8'in 37.5 mikrolitrelik 10 milimolar TRIS hidroklorüründe yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Plakayı tekrar manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların beş dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Süpernatantın 36,5 mikrolitresini taze bir termosiklet uyumlu 96 delikli plakaya aktarın ve boncukları atın.Hücre kalitesi değerlendirmesi yapıldıktan sonra, hücre görünümü ve yüzdesi incelenerek düşük kaliteli embriyonik kök hücrelerin kullanılmaması gerektiği gösterilmiştir. Hoechst 33342 boyası kullanılarak tek hücreli sıralama yapıldı ve her bir kuyucukta sıfır veya bir hücre bulunduğundan emin olmak için test hücreleri sayıldı. Agarose jel analizi, düşük moleküler ağırlıklı bir merdiven ve bireysel tek hücreli uliCUT & RUN kütüphanelerini ortaya çıkardı.Suboptimal ve optimal kütüphane analizleri düşük molekül ağırlıklı bir merdiven, verimsiz Mnaze sindirimi nedeniyle suboptimal kütüphane ve uygun sindirime sahip başarılı bir kütüphane göstermektedir. Parça analizörü dağılımı, beklenen tek hücreli boyutun 150 ila 500 baz çifti arasında değiştiğini göstermektedir. Bununla birlikte, büyük proteinlerde, DNA yaklaşık 270 baz çiftine sahip olacaktır.Yüksek hücre sayısını veya negatif kontrolü gösteren tek lokuslu genom tarayıcısı ve tek hücreli CTCF uliCUT & RUN kullanılarak protein doluluğu, tek hücrenin büyük ölçüde yüksek hücreli uliCUT & RUN'a benzer şekilde güçlü zirveleri temsil ettiğini ortaya koymuştur. Tek hücreli CTCF veya negatif kontrolün ısı haritaları, hücrelerdeki yerleşik CTCF bağlanma bölgeleri üzerinde doğrudan net bir okuma zenginleştirme paterni ortaya koymuştur. Tek boyutlu ısı haritaları, çevre bölgelere ve antikor içermeyen kontrollere göre tek hücreli kütüphanelerde kurulu CTCF bağlanma bölgelerine göre daha yüksek bir okuma yoğunluğu gösterir ve yerleşik bağlanma bölgelerinde antikora özgü zenginleştirme gösterir.Buzlu su banyosundaki boncuk bağlı çekirdeklerin dengelenmesi ve kalsiyum klorür ilavesi üzerine numunenin aşırı ısınmaması, kromatinin aşırı sindirimini önlemek için önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...