Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

يعترف المؤلف بالدكتور كريستيان ديرنتل من قسم التكنولوجيا الحيوية وعلم الأحياء الدقيقة في TU Wien وقسم الطب الثالث ، قسم أمراض الكلى وغسيل الكلى في جامعة فيينا الطبية ، وخاصة الدكتور ماركوس وهرمان للدعم الفني والعلمي. تم دعم تعبير البروتين في خلايا الثدييات من قبل قسم التكنولوجيا الحيوية في جامعة الموارد الطبيعية وعلوم الحياة (BOKU) في فيينا. تريد الكاتبة أن تعرب عن تقديرها العميق للدكتور نيكو دانكبار من XanTec bioanalytics في دوسلدورف ، ألمانيا ، لإجراء مناقشات علمية مفيدة حول إجراء فحوصات ربط SPR.

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام بروتين اندماج صغير يشبه يوبيكويتين (SUMO) CVN في مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم بدلا من CV-N وهو مناسب للمقايسات القائمة على الخلايا. يتم الحصول على بروتين HA H3 لفيروس الأنفلونزا الكامل المؤتلف تجاريا (انظر جدول المواد) أو يتم التعبير عنه ف?...

يرتبط تقارب ربط CV-N بعدد مواقع الربط الوظيفية [2H على المجالات B ، و 2L على المجال (المجالات) A عند هندستها كثنائي مبدل بالمجال]. يتم التعبير عن متغير مع تقارب ربط متغير (CVN2L0-V2 ، طية مستقرة متجانسة من CV-N تتكون من ضربة قاضية لجسر ثاني كبريتيد) في الإشريكية القولونية ، وتنقيتها ، واختبارها إيجا...

يتم تحفيز النشاط المضاد للفيروسات المرتبط ب Tetherin بواسطة α الإنترفيرون ، وهو يشتمل على حبال قائمة على البروتين ، مما يؤدي إلى الاحتفاظ بالفيروسات المشكلة بالكامل على أسطح الخلايا المصابة1. لا تزال ضرورة غليكوزيل التيثرين في تثبيط إطلاق الفيروس غير مؤكدة ، مما يعني أهمية أنماط الجليكوزيل على الجليكان المعبر عنه بشكل مؤتلف للدراسات المختبرية 1,2 ، والتي تعتمد على تشكيل (في حالة فيروس الأنفلونزا) الأنفلونزا المعبر عنها سطحيا هيماغلوتينين HA 3,4 . وقد لوحظ أن تعديل قليل السكاريد المربوط بالجليكوزيل المرتبط ب N يكفي لتقييد إطلاق فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1بوساطة التيثرين 2 ، بينما يلعب dimerization دورا أساسيا في منع إطلاق الفيروس ، وبالتالي إشراك المجال عبر الغشاء أو مرساة جليكوزيل فوسفاتيديل إينوسيتول (GPI) لربط الفيروسات الناشئة5 . يتم وصف الميزات الفريدة للحبل البشري والفئران لمنع العديد من الفيروسات المغلفة والفيروسات القهقرية والفيروسات الخيطية. BST-2 / tetherin هو بروتين مضاد للفيروسات يمكن تحريضه بواسطة الإنترفيرون للمناعة الفطرية 1,6 ، ويعمل مع نشاط مضاد للفيروسات واسع الطيف ويتم معاداته بواسطة البروتينات السكرية المغلفة5 إما لنقل التيثرين أو تعطيل بنية التيثرين 6. على سبيل المثال ، يعرف البروتين السكري المغلف المعبر عنه سطحيا HA والنورامينيداز على فيروس الأنفلونزا A بمعاداة التيثرين بطريقة خاصة بالسلالة7 ، مما يسهل التعرف على مواقع ربط مستقبلات المضيف8. تتم دراسة الأجسام المضادة التي تستهدف الجليكان في القياس المتكافئ لتفاعلاتها مع دروع الجليكان سريعة التخصيص على HA ، مما يؤدي إلى تقارب ملزم بالنوعين الفرعيين4 من الأنفلونزا A H3N2 و H1N1.
لتوضيح آليات الربط بين العوامل المضادة للفيروسات وطفرات غلاف الفيروس ، أي روابط الكربوهيدرات ، والطرق المناعية والطيفية التكميلية ، يتم تصنيع شقوق أحادية وثنائية وثلاثية مانوز كيميائيا. يتم إنشاء الببتيدات المانوسيلية عن طريق أزيدو جليكوزيل من جليكوزيل {بيتا}-بيراسيتات إلى 1،2-trans glycosyl azidesتحويل 9 ، مما يحاكي الجلوكوزامين N-acetyl الموجود عادة وقليل السكاريد عالي المانوز على سطح الفيروسات التي تهدد الحياة. تستخدم الإيزوكوسترات الحيوية التريازول لتقليد الروابط التي تشكل بقايا مانوسيلات من ببتيد HA10 وتسهيل التفاعلات الخاصة بالموقع مع مشتقات CV-N المضادة للفيروسات حول بقعة الجليكوزيل الثانية المرتبطة ب N على مجال رأس HA (قمة HA مع 4 جليكان مرتبط ب N N54 ، N97 ، N181 ، N301) 8،11،12 . أظهرت التفاعلات بين حمض الجلوتاميك (Glu) والأرجينين (Arg) وثنائي القطب الحلزوني الناتج استقرارا جيدا لكل من الببتيدات النموذجية والبروتينات ولكن يتم تصورها باستخدام SPR. إذا ما قورنت بالتعرف على موقع جليكوزيل واحد مركب كيميائيا على HA10 عن طريق تثبيط ارتباط المستقبلات مباشرة على شقوق الجليكان ، فإن التقارب الأعلى لهيكل Fc المتحور المكون من أربعة مواقع لمستقبلاته يظهر أنه يستنبط وظائف المستجيب في الجسم الحي ، مما يكشف عن التركيب غير ذي الصلة للجليكان المرتبط ب N المرتبط بمتحولة Fc ليتم تحديده ميكانيكيا13.
يعرض CV-N نشاطا مضادا للفيروسات ضد فيروس نقص المناعة البشرية 14،15 والإنفلونزا16 وفيروس الإيبولا ، والذي يتم بوساطة الارتباط النانوي بتعديلات قليل السكاريد عالية المانوز على بروتينات سبايك المغلف 12،17،18،19. تم تحديد ارتباط الأنفلونزا HA بموقع واحد عالي التقارب لربط الكربوهيدرات (H) في CV-N أو اثنين من Hs في CVN2 ثنائي الارتباط تساهميا للحصول على ثوابت تفكك التوازن (K D) = 5.7 نانومتر (الشكل 1A) و KD = 2.7 نانومتر ، على التوالي. يحتوي كل من CV-N و CVN2 على واحد أو اثنين من مواقع ربط الكربوهيدرات منخفضة التقارب (L) s12،17،20،21. يرتبط الإيبولا GP1,2 ب 2H من CVN2 مع تقارب في النطاق النانوي السفلي (KD = 26 نانومتر). يظهر ارتباط CV-N WT بالإيبولا GP1,2 و HA صلات من K D = 34 نانومتر إلى KD = 5.7 نانومتر (A / New York / 55/04)12. الليكتين ، مثل CV-N ، الذي يستهدف على وجه التحديد جليكان عالي المانوز على الأظرف الفيروسية ، يمنع تكاثر فيروس التهاب الكبد C ، و SARS-CoV ، وفيروس الهربس ، وفيروس ماربورغ ، وفيروس الحصبة22.
تمت دراسة جزيء CV-N الصغير بدقة لأكثر من 20 عاما لأنه يعمل على ربط مجموعة واسعة من الفيروسات لمنع دخول الفيروس16,18. تشير التحليلات الهيكلية ومقايسات تقارب الربط إلى الربط المتقاطع لاثنين من Ls في ثنائي CVN2 المبادل بالمجال عن طريق الارتباط ثنائي التكافؤ في نطاق micromolar لتعزيز الحساسية للبروتينات السكرية المغلفة الفيروسية10,19. يتكون الارتباط الانتقائي ل Manα1-2Manα على أذرع Man(8) D1D3 و Man(9) من موقعين ملزمين لهما صلات مختلفة يقعان على بروتومرات البروتينالمعاكسة 20 ، وبالتالي الوصول إلى تقارب الارتباط النانوي (الشكل 1B). وبالتالي ، يعتبر CVN2 جسما مضادا زائفا فيما يتعلق بتطبيقه لربط الحواتم على فيروس نقص المناعة البشرية gp120 ، على غرار الأجسام المضادة المعادلة للفيروس17. هنا ، يهتم المؤلف بالتحقيق في الارتباط المحتمل ل CVN2 بارتفاع SARS-CoV-2 عبر مجال ربط المستقبلات (RBD). تؤدي منحنيات الربط للإنزيم البشري المحول للأنجيوتنسين (ACE) -2 مع SARS-CoV-2 RBD إلى KD = 4.7 نانومتر لهذا التفاعل المرتبط بيولوجيا23.
على النقيض من ذلك ، تتعرف فئات الغلوبولين المناعي المختارة على أنماط البروتين الهيكلية المحددة والمتسقة ، والتي تضفي ركيزة لنضج التقارب في مناطق HA المثبتة بالغشاء24. يظهر CV-N نشاطا قويا للغاية في جميع فيروسات الأنفلونزا A و B تقريبا16 ، وهو عامل مضاد للفيروسات على نطاق واسع. معرفتنا غير مكتملة حول موقع الحلقات المستهدفة على جذع HA1 و HA2 والتي ربما تتضمن هياكل epitopic لاستهداف الجليكان بواسطة أجسام مضادة شديدة التحييد وبالمقارنة مع ربط الليكتين25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> الشكل 1: تمثيل تخطيطي لمقايسة ربط SPR ل CV-N إلى طفرات غلاف الفيروس. (أ) مقايسة SPR لربط CV-N بالليجند: بروتين HA كامل الطول (90 كيلو دالتون). مجموعة البيانات الحركية (5120 ، 2560 ، 1280 ، 640 ، 320 ، 160 ، 80 ، 40 ، 20 ، 10 ، 5 ، 2.5 ، 0 نانومتر) تظهر الارتباط المرجعي المزدوج في الوقت الفعلي بالأنفلونزا HA A / New-York / 55/04 (H3N2). (B) ارتباط متغير CVN2L0 V2 بربط DM المجمد ضمن نطاق تركيز يتراوح بين 500 نانومتر و 16 ميكرومتر. التسلسل: يتم تمييز بقايا L باللون الأصفر. يتم تمييز بقايا H باللون الرمادي. E58 و R73 هما بديل للسيستين في البروتين البري ويجعلان V2 طية بروتين مستقرة مع ثلاثة بدلا من أربعة روابط ثاني كبريتيد <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
في حين أن درع الجليكان الموجود على الجزء العلوي من HA البعيد الغشائي يحفز ارتباطا عالي التقارب ب CV-N 12 ، فقد لوحظ ارتباط CVN2 ب HA المجاور لجسر ثاني كبريتيد الجزء العلوي من HA في مواقعه منخفضة التقارب10,12. يتم تحديد التفاعلات القطبية المختلفة ومواقع التفاعل في ربط الكربوهيدرات بواسطة CV-N. يتم التحقق من هذه التفاعلات عن طريق توليد متغيرات خروج المغلوب في موقع الربط لربط صلات الربط في السيليكو المتوقعجليكوزيل 12. وبالتالي ، يهدف المشروع إلى مقارنة ببتيدات HA التي تم اختبارها كيميائيا سابقا في تقارب وخصوصية ملزمة مع تسلسلات ببتيد قصيرة من طفرات 2019-nCoV المرتبطة بالسارس و SARS-CoV-2 ، والتي تحدث بشكل طبيعي معدلة بواسطة عدد صغير من مواقع الجليكوزيل المختلفة المرتبطة ب N والجليكوزيل المرتبط ب O. باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد وفحوصات الربط ، أبلغ بينتو وزملاؤه عن جسم مضاد أحادي النسيلة ، S309 ، من المحتمل أن يتعرف على حاتم على بروتين سبايك SARS-CoV-2 يحتوي على جليكان محفوظ داخل الجنس الفرعي لفيروس Sarbecovirus ، دون التنافس مع مرفق المستقبل26. يصف بروتوكول هذه الدراسة مدى أهمية تصميم متغيرات CV-N والتعبير عنها وتوصيفها لدراسة كيفية ارتباط CV-N و CVN2 بالبروتينات الغليكوزيلاتية والببتيدات الاصطناعية باستخدام تقنية SPR10,12.
يتم التعبير عن ثنائي التدوير المرتبط بالترادف CVN2L027 ومتغيرات موقع الربط (V2-V5) بشكل مؤتلف والمتغيرات مع بدائل رابطة ثاني كبريتيد (C58E و C73R) (الشكل 2 أ). أيضا ، يتم إعداد طفرة مع طفرة أحادية النقطة E41A لأن هذا الموقف ينظر إليه على أنه بقايا تلامس بين الجزيئات. هذا الطفرة هي جزيء آخر مثير للاهتمام لقياسات ربط SPR بين الليكتين والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز التي تفك رموز مجالات الربط وتسمح بالمقارنة مع الشكل الثنائي. يظهر الهيكل البلوري المبدل المجال ل CVN2 رابطا مرنا يمتد بين 49 و 54 بقايا. يمكن أن يستمر المجالان في التحرك حول المفصلة كأجسام صلبة ، ويطوران إما مونومر من خلال تفاعلات المجال داخل الجزيئات (المجال A - بقايا 1-39 ؛ 90-101- مع المجال B - بقايا 40-89) أو ثنائي عن طريق تبديل المجال بين الجزيئات [المجال A (من المونومر الأول) مع المجال B (من الثاني) ، والمجال B (من المونومر الأول) مع المجال A (من النسخة الثانية)]. لا توجد تفاعلات وثيقة بين المجالين A و B للأوليين ، باستثناء Glu4128. يمكن تطوير جين CV-N باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتكررة مع أوليغوس29 المركب 40 مير ثم يتم استنساخه في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا كهروبيئية كما وصفها Keeffe، J.R.27. يتضمن البروتين ، الذي يستخدم لتحقيق البنية البلورية المعنية (PDB ID 3S3Y) ، علامة تنقية N-terminal 6-histidine متبوعة بموقع انقسام البروتياز العامل Xa. يستخدم الطفرات الموجهة للموقع لعمل طفرات نقطية ، وتبديل الكودونات ، وإدخال أو حذف قواعد أو كودونات مفردة أو متعددة لتبادل الأحماض الأمينية. توفر هذه التحولات نظرة ثاقبة لا تقدر بثمن في وظيفة البروتين وهيكله. تمت دراسة CV-N و CVN2 و CVN3 المعبر عنها وتنقيتها بشكل جيد من الناحية الفيزيائية الحيوية20،21،27 ، وهي رخيصة الإنتاج ، وبالتالي تستخدم لتوصيف مقايسات الربط بالجليكان المثبت على رقائق مستشعر SPR. يوفر مقايسة الممتز المناعي التقليدي المرتبط بالإنزيم (ELISA) قابلية استنساخ أقل فيما يتعلق بتقنية تجميد روابط الجليكان ويحول الارتباط في الوقت الفعلي لمتغيرات موقع الربط المختلفة ، والتي تظهر ل SPR ، إلى مقايسات نقطة النهاية.
يتم التعبير عن متغير التقارب المرتبط CVN2L0-V2 (طية سليمة من CV-N المتجانس مع استبدال جسر ثاني كبريتيد10) بعلامة His-tag في الإشريكية القولونية (E. coli) ، ويتم تنقيتها فوق عمود Ni-NTA باستخدام كروماتوغرافيا التقارب واختبارها للارتباط ب HA (H3N2) ، ببتيد HA-أحادي المانوسيلات وببتيد HA-ثنائي المانوسيلات باستخدام SPR. الببتيدات المانوسيلية كيميائيا ، أو بروتين HA و S ، كلها روابط وأمين مقترنة بسطح الرقاقة المحبة للماء عن طريق الإسترات التفاعلية أو هندسة بروتين البيوتين ستربتافيدين. يتم تطبيق نفس الإجراء الخاص بالتشغيل المتسلسل على تلك الروابط ، وحقن التخفيفات المختلفة ل CV-N ومتغيرات CV-N (و CVN2) للحصول على معلومات حركية لتحليلات التفاعل الجزيئي كما هو موضح أدناه30. تستخدم رقاقة مستشعر SPR المجمدة RBD لدراسات الربط على ببتيدات CV-N إلى S ، وتتم مقارنة الصلات بربط SARS-CoV-2 مع ACE2 البشري.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

يستخدم رنين البلازمون السطحي (SPR) لقياس ارتباط الهيماجلوتينين (HA) بثنائي ثنائي السيانوفيرين-N (CV-N) المبادل بالمجال ولمراقبة التفاعلات بين الببتيدات المانوسيلية وموقع الارتباط عالي التقارب ل CV-N. تم الإبلاغ عن طفرات غلاف الفيروس gp120 و HA و Ebola glycoprotein (GP) 1,2 لربط كل من مواقع الربط عالية ومنخفضة التقارب على CVN2 الثنائي. يرتبط ببتيد HA ثنائي المانوسيلات أيضا في موقعي الربط منخفض التقارب بجزيء مهندس من CVN2 ، والذي يحمل موقعا عالي التقارب لليجند المعني ويتحور ليحل محل رابطة ثاني كبريتيد مستقرة في جيب ربط الكربوهيدرات ، مما يؤكد الارتباط متعدد التكافؤ. يظهر ارتباط HA بموقع ربط عالي التقارب للجسم المضاد الزائف CVN2 عند ثابت تفكك (KD) يبلغ 275 نانومتر مما يزيد من تحييد فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) من خلال قلة القلة. يؤدي ربط عدد جسور ثاني كبريتيد في CVN2 المبادلة بالمجال ، والتي يتم تقليلها من 4 إلى 2 عن طريق استبدال السيستين في أزواج بقايا قطبية من حمض الجلوتاميك والأرجينين ، إلى تقليل تقارب الارتباط ب HA. من بين أقوى التفاعلات ، يرتبط الإيبولا GP1,2 ب CVN2 مع موقعين ملزمين عالي التقارب في النطاق النانوي السفلي باستخدام غلاف الجليكان بدون مجال عبر الغشاء. في هذه الدراسة ، يتم قياس ارتباط CV-N أحادي متعدد الأنواع بفيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) سبايك (S) بروتين سكري عند K D = 18.6 μM مقارنة ب nanomolar KD لتلك المسامير الفيروسية الأخرى ، وعبر مجال ربط المستقبلات في نطاق منتصف μ المولي.

يتم اختبار جزيء CVN2L0 ثنائي المجال المبدل للارتباط بالمنطقة العليا HA في ثلاث تجارب SPR منفصلة ويتم تقديم تقارب الربط بقيم KD. يفترض أن المجال B يشتمل على مواقع ربط H ، والتي تتأثر باستبدال رابطة ثاني كبريتيد في بقايا أيونية ، ويشكل المجال A L10,18. يتم اختبار ال...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

يصف البروتوكول الحالي أدوات جديدة لمقايسات ربط SPR لفحص ارتباط CV-N ب HA ، والبروتين السكري S ، والجليكان الهجين ذي الصلة ، والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز. يستخدم SPR لتحديد KD لربط إما ثنائي أو أحادي CV-N بهذه الجليكانات.

هندسة العوامل المضادة للفيروسات عبر رنين البلازمون السطحي

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

تم إنشاء التحليل الطيفي بالرنين البلازموني السطحي لتحديد ليجند البروتين بطريقة إنتاجية متوسطة. يتم تقديم صلات مختلفة لمتغيرات موقع الربط لنفس الجزيء ، وهي لقليل السكاريد عالي الجودة المرتبط بالحديد على الفيروسات. SPR هي تقنية خالية من الملصقات لدراسة الارتباط الجزيئي في الوقت الفعلي للمستقبلات الثابتة السطحية.يتم التعرف على التفاعلات متعددة المواقع في التحليل الحركي عن طريق الربط التنافسي بشكل مستقل عن حجم المجالات المحددة في الأبحاث التي تستخدم SPR هي تطوير الأدوية للبحث عن مثبطات أو توصيف الأجسام المضادة. يتم حساب الثوابت والصلات الحركية مباشرة من استجابة المستشعر. للبدء ، انقل 100 ميكرولتر من المحلول على ألواح LB-agar وانشرها برفق باستخدام موزع خلية معقمة.ابدأ سلسلة من تفاعلات العينات باستخدام تركيزات متعددة من قالب الحمض النووي المزدوج الشريط تتراوح من خمسة إلى 50 نانوجرام مع الحفاظ على تركيز التمهيدي ثابتا. ثم أضف إنزيم تقييد DpnI أسفل تراكب الزيت المعدني واحتضانه على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لهضم الحمض النووي الأبوي المزدوج الذي تقطعت به السبل. لإذابة الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue ، قم بتقسيم الخلايا إلى أنبوب سفلي صغير مستدير مبرد مسبقا.بعد ذلك ، انقل ميكرولترا واحدا من الحمض النووي أحادي الشريط المعالج من كل عنصر تحكم وتفاعل عينة إلى حصص منفصلة من الخلايا فائقة الكفاءة التي توليف الشريط التكميلي. بعد تحريك تفاعلات التحول بعناية للخلط ، احتضان التفاعلات على الجليد لمدة 30 دقيقة. ضع نبضة حرارية على تفاعلات التحول عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ثم ضع التفاعلات على الجليد لمدة دقيقتين.ثم أضف 0.5 ملليلتر من NZY + Broth واحتضان تفاعلات التحول عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225 إلى 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بلوحة الحجم الصحيح لكل تفاعل تحويل على ألواح LB Ampicillin Agar كما هو موضح سابقا. بالنسبة لثقافة البذور ، قم بتلقيح كمية صغيرة من الأمبيسلين المحتوي على وسائط LB مع مستعمرة واحدة من اللوحة المحولة.باستخدام الثقافة الليلية ، قم بتلقيح ثقافة التعبير بإضافات بما في ذلك 10 ملليمولار من كلوريد المغنيسيوم ، و 10 ملليمولار من كبريتات المغنيسيوم ، و 20 ملليمولار من الجلوكوز ، مما يخفف من زراعة البذور إلى واحد في 100. بعد ذلك ، تنمو الخلايا ذات الاهتزاز القوي عند 37 درجة مئوية إلى 600 نانومتر ماص بين 0.4 إلى 0.6 قبل تبريد الخلايا إلى 20 درجة مئوية والحث باستخدام ملليمولار واحد IPTG وتنمو بين عشية وضحاها. ثم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية وتجاهل الطاف .بعد إعادة تعليق بيليه الخلية في الفوسفات العازلة المالحة المخزنة ، الملجأ الأخير في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم تجاهل الطاف مع ماصة. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 10 ملليلتر من محلول التحلل واحتضان التعليق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.ثم فصل الكسور القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم HIS-Select Ni2 + Affinity Gel في أنابيب سعة 14 ملليلتر لربط وإعادة تعليق السيانوفيرين-N الموسوم به بشكل مؤتلف في المحاليل العازلة مع 20 ملليمولار إيميدازول و 250 مليمولار إيميدازول ، على التوالي. احتضان دفعة واحدة لمدة 30 دقيقة على الأقل بين هذه الخطوات.إضافة محلول الشطف الذي يحتوي على 250 مليمولار إيميدازول لتخفيف البروتين. انقل محاليل البروتين إلى أنابيب الطرد المركزي باستخدام مرشح قطع دالتون 10 كيلو وركزها بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 4،500 جم وأربع درجات مئوية. أضف المخزن المؤقت لتشغيل SPR إلى عامل تخفيف من واحد إلى 10 وأجهزة الطرد المركزي أربع مرات إلى الحجم الأولي لمدة 10 دقائق عند 4،500 جم وأربع درجات مئوية.بعد ذلك ، حدد تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية NanoDrop بناء على معامل الانقراض المحسوب للبروتين الرئيسي CVN2L0 الذي يظهر حجما 23،474 دالتون. بالنسبة لنظام SPR ثنائي القناة ، استخدم HBSCP plus كمخزن مؤقت قيد التشغيل ، وحمض هيدروكلوريك جليكاين 10 مللي مولار من الأس الهيدروجيني 1.5 إلى 1.6 كمخزن مؤقت للتجديد وقم بتشغيل جهاز إزالة الغازات وأخذ العينات التلقائي والمضخة. ثم اغسل النظام بأكمله بالماء المقطر المزدوج لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك ، قم بإسقاط زيت الغمر على الكاشف وقم بتركيب شريحة مستشعر زجاجية مطلية بغشاء ذهبي رقيق. وعلى الجانب العلوي ، تعمل مع هيدروجيل كربوكسي ميثيل ديكستران مباشرة على الكاشف أسفل خلية التدفق ثلاثية المنافذ. ثم قم بإصلاح الإعداد عن طريق سحب المناولة لأسفل.لشل حركة الروابط البروتينية إلى رقائق المستشعر ، افتح جدول تشغيل بالنقر فوق نموذج في شريط القائمة وقم بتشغيل محرر الجدول في برنامج الارتباط التلقائي SPP المدمج. ثم اختر وانقر فوق التثبيت الأساسي من قائمة جداول التشغيل المتاحة واتبع خطوات الإجراء التجريبي على شاشة الكمبيوتر. بعد ذلك ، انقر فوق محرر مجموعة العينات في قسم النموذج لملء قائمة الكواشف لرفين موضوعين في أخذ العينات التلقائي لمزيد من التحليل.انقر فوق التحكم المباشر في أخذ العينات التلقائي كأداة في شريط القائمة لإعادة الرفوف إلى الأمام أو إلى المنزل واختيار أربع درجات مئوية كدرجة حرارة التشغيل. ابدأ تشغيل المضخة لضخ الماء المقطر المزدوج عن طريق النقر على الأدوات والتحكم المباشر في المضخة. وتسجيل البيانات من خلال النقر على التحكم المباشر في أداة SPR.وفي كل مرة ، ابدأ في النافذة التي تظهر حديثا. بعد إضافة كواشف التوصيل في قارورة 300 ميكرولتر ، ضعها في رفوف أخذ العينات الأوتوماتيكية وابدأ جدول التشغيل بالنقر فوق تشغيل. للتفاعل البسيط بين البروتين والبروتين ، بعد إعادة تعبئة المضخة بمعدل 25،000 ميكرولتر في الدقيقة ، قم بإجراء تعديل خط الأساس لمدة 30 ثانية.اترك التعديل الأساسي اللاحق بالماء المقطر المزدوج لمدة 1.5 دقيقة قبل إخماد سطح الرقاقة المنشط بهيدروكلوريد إيثانولامين مولاري واحد ، درجة الحموضة 8.5. ثم قم بتبديل الأنابيب من جهاز أخذ العينات السائل إلى جهاز إزالة الغازات من الماء المقطر المزدوج إلى الزجاجة باستخدام HBS-EP + انقر فوق النموذج ، وقم بالتمرير لأسفل ، وقم بالتغيير إلى المعالجة اللاحقة بالنقر فوق وضع التشغيل هذا. ثم انقر فوق إضافة لتحديد منحنيات الربط التي تم إنشاؤها بمرور الوقت في النظام الأساسي للبيانات لكل خلية تدفق وقم بتصدير التراكب كملف تنظيف.بعد ذلك ، انقر فوق ملف لفتح خيارات حفظ الملف والحصول على منحنيات الاستجابة عن طريق محاذاة المنحنيات اليمنى واليسرى وطرح إشارات القناة المرجعية الثانية من تلك الخاصة بقناة الرباط. تم اختبار الحقن المفردة ل CVN2L0 والتباين V2 و V5 لأول مرة للارتباط برقاقة المستشعر المقترنة بالهيماجلوتينين لتقدير قدرات الربط باستخدام أخذ العينات الأوتوماتيكي ومحرر الجدول قيد التشغيل. تم أتمتة الحقن المتكرر بتركيزات مختلفة في النطاق النانوي والميكرومولي في النظام بمرور الوقت مما يدل على عدم تحقيق أي تشبع على سطح الرقاقة أو ارتباط التوازن.تم رسم التركيز مقابل الاستجابة لارتباط CVN من النوع البري ب RBD ، بافتراض استهداف محدد للكربوهيدرات المحفوظة المحتملة على الوحدة الفرعية RBD S1 ذات التقارب الأضعف مع وجود ثابت معدل تفكك يبلغ 260 ميكرومول. لم يعد مخطط التقارب نفسه لربط CVN2L0-V4 ب DM قابلا للتحليل بسبب استبدال روابط ثاني كبريتيد التي تتداخل مع الارتباط عالي التقارب مع الببتيدات الصغيرة الغليكوزيلاتية وتنتج استجابة أعلى من القيمة القصوى للاستجابة. يظهر الارتباط البري من النوع CVN ب RBD على SARS-CoV-2 الارتباط ببروتين S و RBD مع ثابت غضب تفكك يبلغ 18.6 ميكرومول و 260 ميكرومول ، على التوالي.على الرغم من أن استجابة SPR لتركيزات التحليل تؤدي إلى وحدات استجابة عالية وحساسات SPR نموذجية لربط CVN من النوع البري و E41A. ومع ذلك ، فإن المسخ غير مستقر عند تخفيفه. يعالج الاستشعار الحيوي SPR الارتباط عالي التقارب ومنخفض التقارب للبروتينات النقية ومتغيراتها بالروابط.في حالتنا ، تستغل البروتينات السكرية القراءات البصرية ونظام التدفق ثنائي القناة على سطح رقاقة المستشعر. الإنزيم كونه مقايسة الممتز المناعي هو طرق مناعية بديلة تتعرف على حوائط البروتين ولكنها توفر أيضا بيانات عن تركيز الببتيدات والجزيئات الصغيرة من المصفوفات المعقدة. اختبار البروتينات المعبر عنها بشكل مؤتلف بواسطة مقايسات ربط SPR تضمنت الاستشعار الحيوي للتغيرات التأكيدية وهو أمر مفيد للتحقق والتنبؤ باستقرار البروتين من خلال جانب البروتين الحسابي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Procedure for Lung Engineering

الداخلي للهندسة الرئة

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

المغناطيسي منهجية Elastography الرنين لتقييم الأنسجة المهندسة النمو كونستركت

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

ربط المسابر البيولوجي لأجهزة الاستشعار البصرية عن طريق وكلاء السيليكا اقتران silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

الكمية الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) تحليل لتحديد حركية SENP1 البروتياز

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

ألياف النانو البروتين ECM والنانو المهندسة طريق الجمعية بمبادرة السطحية

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

هندسة الأنسجة عن طريق الجوهرية الأوعية الدموية في<em&gt; في فيفو</em&gt; غرفة هندسة الأنسجة

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...