Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

يود المؤلفون أن ينتفهموا بروفيسور . لين ماري بيركهولتز والدكتورة جانيت ريدر من قسم الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة وعلم الأحياء الدقيقة ، معهد المكافحة المستدامة للملاريا ، في جامعة بريتوريا ، لزراعة وتزويد ثقافة الخلايا المشيمة. تم الحصول على سلالة الطفيليات من القسم الأخير (وليس جزءا من هذا المنشور). قسم العلوم والابتكار (DSI) والمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) ؛ مبادرة كراسي البحث في جنوب أفريقيا (UID 64763 إلى LK و UID 84627 إلى LMB) ؛ مجتمعات الممارسة NRF (110666 إلى LMB و LK) ؛ كما تم الاعتراف بشراكات الابتكار الصحي الاستراتيجية لمجلس البحوث الطبية في جنوب أفريقيا (SHIP) للحصول على أموال من DSI.

ارجع إلى الشكل 1 للحصول على توضيح للبروتوكول. تم الحصول على تصريح أخلاقي من لجنة أخلاقيات العلوم الصحية بجامعة بريتوريا (506/2018) لسحب واستخدام الدم البشري.
1. ثقافة الخلايا المشيمية
ملاحظة: قبل إنشاء SMFA، تم إعداد ثقافة gametocyte في جامعة بريت...

ولكي يتم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، ينبغي إيلاء الاهتمام لكل خطوة، على الرغم من أنها قد تكون عملية شاقة وشاقة. واحدة من أهم الخطوات هي التأكد من أن ثقافة gametocyte ذات نوعية جيدة وأنها تتكون من خلايا الأمشاج الناضجة ، مع نسبة الذكور إلى الإناث الصحيحة ، قبل بدء SMFA23,24<sup class="xr...

ولا تزال الملاريا، المعروفة بأنها واحدة من أكثر الأمراض تدميرا في جميع أنحاء العالم، تشكل تهديدا كبيرا للعديد من البلدان - وخاصة تلك الموجودة في المنطقة الأفريقية - وتساهم في حوالي 95٪ من الحالات في جميع أنحاء العالم1. يحدث هذا المرض بسبب طفيلي أولي ، ويمكن أن يسبب هؤلاء الجناة ، إلى جانب ناقل البعوض Anopheles ، ضررا كبيرا للمضيف البشري2. وبشكل أكثر تحديدا، فإن الأنواع المنجلية من جنس طفيليات المتصورة مسؤولة عن ما يقدر بنحو 99٪ من حالات الملاريا في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إلقاء اللوم على العديد من نواقل البعوض الرئيسية في الأنوفيليس (بما في ذلك An. gambiae Giles، وAn. arabiensis Patton، وAn. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n.، وAn. funestus Giles) في أكثر من 95٪ من انتقال الطفيليات على مستوى العالم 3,4,5,6,7,8 . ومن أجل إثبات الرفقة المثالية لنقل الطفيليات، ينبغي أن يكون ناقل البعوض عرضة للطفيلي وأن يكون قادرا على نقله9. علاوة على ذلك ، يجب على كل من الناقل والطفيلي التغلب على الحواجز المادية لتشكيل مزيج معدي مثالي - يجب أن يكون ناقل البعوض قادرا على الحفاظ على تطور الطفيلي ، ويجب أن يكون لدى الطفيلي القدرة على التغلب على آليات الدفاع الخاصة بالمضيف 10,11.
تلعب الخلايا المشيمة ، وهي المرحلة الجنسية لطفيلي P. falciparum ، دورا حاسما في ربط شركاء الناقل والطفيلي12. يحدث التطور الجنسي في الجسم الحي ، ويصف تكوين الخلايا المشيمائية عملية تمايز خلايا الأمشاج الناضجة إلى أمشاج صغيرة ذكورية متحركة وأمشاج كبيرة أنثوية13. عملية أخرى تحدث داخل البعوض هي الجلد - وهي العملية التي تتحول خلالها خلية الأمشاج الذكرية إلى أمشاج وتخرج من خلايا الدم الحمراء التي يتم تناولها أثناء وجبة الدم11. ويقترح كذلك تعزيز عملية الجلد من خلال تغيير إيجابي في بيئة البعوض midgut14. بعد الضرب ، يتم تشكيل zygote عن طريق اندماج الأمشاج الذكور والإناث13. من الزيجوت ، ينشأ أوكينيت متحرك وينتقل من وجبة الدم إلى ظهارة البعوض midgut13. هنا ، ينضج ookinete ، ويتم تشكيل oocyst ، والذي بدوره ينتج sporozoites المتحركة13,15. ثم تهاجر الأبواغ إلى الغدد اللعابية للبعوض ، وعندما يأخذ البعوض وجبة دم من مضيفه ، يتم حقن هذه الأبواغ في مجرى دم المضيف15.
وقد أصبحت تدخلات مكافحة الملاريا، التي تجمع بين استراتيجيات مكافحة النواقل واستخدام الأدوية الفعالة المضادة للملاريا، حاسمة الأهمية في مكافحة هذا المرض15. ومع ارتفاع مقاومة الطفيليات والبعوض، تزداد الحاجة الملحة إلى تحديد مركبات جديدة مضادة للملاريا16. لذلك ، فإن التقييم في الجسم الحي للمركبات المانعة للانتقال مهم16. بعد تطوير مثل هذه الأدوية الفعالة لمنع انتقال العدوى ، تم استخدام SMFA لتقييم ما إذا كانت هذه المركبات تمنع التطور الجنسي للمتصورة المنجلية في بعوضة الأنوفيليس 17،18،19. اكتسب هذا الفحص اعترافا منذ 1970-1980s كمعيار ذهبي لتقييم منع الإرسال20,21. يوفر هذا الفحص بديلا أرخص من الفحوصات الأخرى مثل RT-qPCR ، والتي تتطلب معدات متخصصة. علاوة على ذلك ، ليست هناك حاجة إلى مرضى لتنفيذ التجارب. يتضمن هذا الفحص أيضا توفير الدم الناجم عن الخلايا الأمشاج لإناث البعوض ، والتي يتم تشريحها بعد ذلك لتقييم ما إذا كان تطور البويضة موجودا21. هذا يسمح بتحديد كمية الخلايا المشيمة والكشف عن البويضات المشوهة بسبب المركبات22. لكي يتم تصنيف مركب على أنه فعال ، يجب تقييم معدل الانتشار (نسبة البعوض الذي يؤوي بويضة واحدة على الأقل في الأمعاء الوسطى) وعدد البويضات (الكثافة) في الأمعاء الوسطى للبعوض لتقييم تثبيط العدوى17،21،22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

ولا تزال الملاريا واحدة من أكثر الأمراض تدميرا في جميع أنحاء العالم، وحتى الآن، لا تزال المنطقة الأفريقية مسؤولة عن 94٪ من جميع الحالات في جميع أنحاء العالم. يتطلب هذا المرض الطفيلي طفيليا أوليا ، وناقلا لبعوض الأنوفيليس ، ومضيف فقاري. يضم جنس Anopheles أكثر من 500 نوع ، منها 60 نوعا تعرف باسم ناقلات الطفيلي. يتكون جنس طفيليات المتصورة من 250 نوعا ، ويشارك 48 منها في انتقال الأمراض. وعلاوة على ذلك، ساهم طفيلي المتصورة المنجلية في تحقيق ما يقدر بنحو 99.7 في المائة من حالات الملاريا في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى في السنوات الأخيرة. 
تشكل الخلايا المشيمة جزءا من المرحلة الجنسية للطفيلي ويتم تناولها من قبل أنثى البعوض عند التغذية على مضيف بشري مصاب. يتم تعزيز مزيد من التطوير للطفيلي داخل البعوض من خلال الظروف البيئية المواتية في منتصف الأمعاء من البعوض. هنا ، يحدث اندماج الأمشاج الأنثوية والذكورية ، وتنشأ ookinetes المتحركة. تدخل الأوكينيت إلى ظهارة الأمعاء الوسطى للبعوض ، وتشكل البوكينيت الناضجة البويضات ، والتي بدورها تنتج بوغية متحركة. تهاجر هذه الأبواغ إلى الغدد اللعابية للبعوض ويتم حقنها عندما تأخذ البعوضة وجبة دم. 
لأغراض اكتشاف الأدوية ، أصيب البعوض بشكل مصطنع بالدم المصاب بالخلايا المشيمية في فحص التغذية الغشائية القياسية (SMFA). للكشف عن العدوى داخل البعوض و / أو لتقييم فعالية المركبات المضادة للملاريا ، تمت إزالة الأمعاء الوسطى من إناث البعوض بعد العدوى وكانت ملطخة بالزئبق. تم استخدام هذه الطريقة لتعزيز الكشف البصري عن البويضات تحت المجهر لتحديد دقيق لانتشار البويضات وكثافتها.

وبلغ العدد الإجمالي لعينات المكافحة التي تم تشريحها 47 عينة، بمتوسط انتشار يصل إلى 89 في المائة وكثافة قدرها 9.5 بويضة لكل معاء متوسطة (الجدول 1، كما نشر سابقا22). بالنسبة للمركب MMV1581558 ، بلغ حجم العينة ما مجموعه 42 عينة ، مع انتشار البويضات بنسبة 36٪ ومتوسط كثافة 1.5 بويضة. وهذ...

Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

يعتبر فحص التغذية الغشائية القياسي (SMFA) المعيار الذهبي لتقييم وتحديد المركبات المحتملة المضادة للملاريا. يستخدم نظام التغذية الاصطناعي هذا لإصابة البعوض لمواصلة تقييم آثار هذه المركبات على شدة وانتشار طفيلي المتصورة المنجلية .

فحص التغذية الغشائية القياسية للكشف عن عدوى المتصورة المنجلية في نواقل البعوض الأنوفيليس

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

ويسمح لنا البروتوكول بالكشف عن أثر العلاج على قابلية نواقل الملاريا الأفريقية للتأثر بالملاريا. على سبيل المثال ، المركبات التي تهدف إلى منع انتقال العدوى من الإنسان إلى البعوض. تسمح هذه التقنية للباحثين بتقييم عدد كبير من المركبات تحت ظروف المختبر ، حتى قبل توفر بوابات السمية.يمكن أن يكون تشريح الأمعاء الوسطى تحديا في البداية ولكنه يتطلب فقط بعض الممارسة. أيضا ، لتكون قادرة على تحديد البويضات ليست دائما سهلة. أولا ، باستخدام شفاط الفم ، ضع 25 أنثى من بعوض Anopheles gambiae غير المتغذى في كوب تغذية 350 ملليلتر.ضع علامة على الكؤوس بوضوح للتمييز بين مجموعات التحكم والعلاج. اختر عدد الأكواب لكل علاج وفقا لعدد النسخ المتماثلة الفنية المضمنة. قم بتوصيل نظام التغذية الزجاجية بحمام مائي وحافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.ثم ، قم بإعداد أمعاء البقرة أو الغشاء الاصطناعي عن طريق شطفها في ماء الصنبور وتقطيعها إلى قطع يتم تركيبها لكل وحدة تغذية. قم بتغطية الجزء السفلي من كل وحدة تغذية واربط الغشاء بشريط مرن. لاستخدام أكواب التغذية كأكواب عدوى ، أولا ، حافظ على الغشاء فوق شبكات الكؤوس.ثم ضع أكواب العدوى تحت المغذيات. الآن ، أضف ملليلتر واحد من الدم المصاب بالخلايا المشيمية إلى مغذيات أكواب التحكم ، والدم المصاب بالخلايا المشيمية مع مركب اختبار إلى مغذيات أكواب العلاج. ثم اترك البعوض لإطعام لمدة 40 دقيقة.بعد الرضاعة ، قم بإزالة المغذيات من الكؤوس ، وشطف المغذيات ، وعالج الدم الزائد بهيبوكلوريت. ثم ، اضرب كل البعوض على الجليد لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، وحدد البعوض الذي تناول وجبة دم من خلال البحث عن البطن المتورمة والحمراء. استبدل ماء السكر الذي يعطى في أيام بديلة لكل كوب عدوى بوسادة ماء سكر بنسبة 10٪ ، واحتضن أكواب العدوى في غرفة السلامة البيولوجية لمدة ثمانية إلى 10 أيام.بعد ثمانية إلى 10 أيام من الرضاعة ، قم بضرب البعوض المصاب عن طريق وضعه على الجليد. ثم ، قم بنقلها إلى أنابيب ذات علامات مع 70٪ من الإيثانول ، مع الحفاظ على التحكم في كل مجموعة علاج في أنابيب منفصلة. مع الحفاظ على مجموعات التحكم والاختبار منفصلة ، قم بنقل البعوض إلى أطباق بتري المبطنة بورق الترشيح.أضف قطرة من PBS على شريحة زجاجية مميزة بشكل مناسب ، وانقل البعوضة من ورقة الترشيح إلى القطرة. دبوس صدر البعوض بإبرة تشريح. ثم ، قم بإزالة القناة الهضمية الوسطى عن طريق سحب الجزء البطني السابع باستخدام ملقط ، ونقله إلى قطرة من 0.1٪ زئبق على شريحة مجهر جديدة.اترك الأمعاء لتلطخ لمدة ثماني إلى 10 دقائق. ثم ضع زلة غطاء على الأمعاء الملطخة ، وشاهدها تحت إضاءة المجال الساطعة عند 20 إلى 40 مرة تكبير. سجل عدد البويضات لكل من منتصف الأمعاء للتحكم وكل مجموعة علاجية.في هذه الدراسة ، وجد أن مركب MMV1581558 يحد بشكل كبير من عدد البويضات المتصورة المنجلية في الأمعاء الوسطى لإناث البعوض الأنوفيلية الغامبية مقارنة بالسيطرة. في المجموعة الضابطة ، كان متوسط انتشار البويضات في الأمعاء الوسطى 89٪ بمتوسط كثافة 9.5 بويضة لكل من الأمعاء الوسطى. ولكن في المجموعة المعالجة MMV1581558 ، كان متوسط انتشار البويضات 36٪ بمتوسط كثافة 1.5 فقط لكل بويضة لكل الأمعاء الوسطى.وهكذا، أسفرت معالجة MMV1581558 عن نشاط منع انتقال بنسبة 58٪ ونشاط الحد من انتقال العدوى بنسبة 82٪ في جميع النسخ البيولوجية الثلاثة. من الأهمية بمكان التأكد من أن البعوض يتغذى على ثقافة أمشاج صحية. إذا كانت هذه الخلايا الأمشاج غير ناضجة ، أو لم تكن المرحلة الخامسة من الخلايا المشيمة ، فإن احتمال الإصابة بالعدوى في البعوض محدود أو مستحيل.يستخدم الفحص طريقة تحديد مورفولوجية بصرية ، ومع ذلك ، يمكن استخدام مقايسات القياس الكمي الجزيئي. غير أن هذا الأمر أكثر تكلفة وقد يحد من استخدامها في المختبرات المحدودة الموارد. إن امتلاك القدرة على القيام بهذه التقنية يفتح آفاقا جديدة لتقييم تغير انتشار الملاريا وشدتها بين أي شيء تقريبا في البعوض.على سبيل المثال ، مقارنة القدرة الناقلة للأنواع.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

تضخيم وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين بالايدز مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد كشفها بواسطة فحوصات السريرية القياسية

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة<em&gt; المتصورة المنجلية</emتبدي الكريات الحمر&gt; بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال<em&gt; المتصورة المنجلية</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

قياس المكتسبة بشكل طبيعي Phagocytosis-تحريض الأجسام المضادة لبلاموديوم فالسيباروم الطفيليات من قبل تدفق Cytometry القائم على المقايسة

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

في المختبر فحص خلايا الدم الحمراء المصابة بالبلازموديوم التي تقتلها الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...