Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Forfatterne vil gerne kvittere for prof. Lyn-Mari Birkholtz og Dr. Janette Reader fra Institut for Biokemi, Genetik og Mikrobiologi, Institut for Bæredygtig Malariakontrol, ved University of Pretoria, til dyrkning og levering af gametocytkulturen. Parasitstammen blev opnået fra sidstnævnte afdeling (ikke en del af denne publikation). Institut for Naturvidenskab og Innovation (DSI) og Danmarks Grundforskningsfond (NRF); Sydafrikanske forskningsformænds initiativ (UID 64763 til LK og UID 84627 til LMB); NRF's praksisfællesskaber (UID-110666 til LMB og LK) og South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) anerkendes også for midler fra DSI.

Se figur 1 for en illustration af protokollen. Etisk godkendelse blev opnået fra University of Pretoria Health Sciences Ethics Committee (506/2018) til tilbagetrækning og brug af humant blod.
1. Gametocytkultur
BEMÆRK: Før oprettelsen af SMFA blev der udarbejdet en gametocytkultur ved University of Pretoria (se Reader et al.22 for den komplette protokol).
<ol><li>Forbered en gametocytkultur...

For at denne protokol skal udføres med succes, skal der lægges vægt på hvert trin, selvom det kan være en kedelig og besværlig proces. Et af de vigtigste trin er at sikre, at gametocytkulturen er af god kvalitet, og at den består af modne gametocytter med det korrekte forhold mellem mand og kvinde, inden SMFA23,24 startes. Under SMFA er det også afgørende at opretholde gametocytkulturen ved den korrekte temperatur for at forhindre mandlige gameter i at u...

Malaria, kendt som en af de mest ødelæggende sygdomme på verdensplan, udgør stadig en stor trussel mod flere lande - især dem i den afrikanske region - og bidrager til ca. 95% af tilfældene på verdensplan1. Denne sygdom er forårsaget af en protozoisk parasit, og sammen med sin Anopheles mygvektor kan disse syndere forårsage stor skade på den menneskelige vært2. Mere specifikt er falciparum-arterne af Plasmodium-parasitslægten ansvarlig for anslået 99% af malariatilfældene i Afrika syd for Sahara1. Ud over dette kunne flere store Anopheles mygvektorer (herunder An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. og An. funestus Giles) skyldes mere end 95% af parasitoverførsel globalt 3,4,5,6,7,8 . For at det ideelle parasitvektorkammeratskab kan etableres, skal mygvektoren være modtagelig for parasitten og være i stand til at overføre den9. Desuden skal både vektoren og parasitten overvinde fysiske barrierer for at danne den perfekte infektiøse kombination - mygvektoren skal være i stand til at opretholde parasitudvikling, og parasitten skal have evnen til at overvinde værtsens forsvarsmekanismer10,11.
Gametocytter, det seksuelle stadium af P. falciparum-parasitten, spiller en afgørende rolle i forbindelsen mellem vektor- og parasitpartnerne12. Seksuel udvikling finder sted in vivo, og gametocytogenese beskriver processen med differentiering af modne gametocytter til bevægelige mandlige mikrogameter og kvindelige makrogameter13. En anden proces, der finder sted i myggen, er exflagellation - den proces, hvor den mandlige gametocyt omdannes til gameter og kommer ud af de røde blodlegemer, der optages under et blodmåltid11. Exflagellationsprocessen foreslås yderligere at blive forbedret ved en gunstig ændring i miljøet i myggen midgut14. Efter exflagellation dannes en zygote ved fusion af de mandlige og kvindelige gameter13. Fra zygoten opstår en bevægelig ookinete og bevæger sig fra blodmelet til epitelet af myggen midgut13. Her modnes ookineten, og der dannes en oocyst, som igen producerer bevægelige sporozoitter13,15. Sporozoitterne migrerer derefter til myggens spytkirtler, og da myggen tager et blodmåltid fra sin vært, injiceres disse sporozoitter i værtsens blodbane15.
Malariakontrolinterventioner, der kombinerer vektorkontrolstrategier og brugen af effektive malarialægemidler, er blevet afgørende for bekæmpelsen af denne sygdom15. Med en stigning i parasit- og mygresistens øges behovet for identifikation af nye malariaforbindelser16. Derfor er in vivo-evalueringen af transmissionsblokerende forbindelser vigtig16. Efter udviklingen af sådanne effektive transmissionsblokerende lægemidler er SMFA blevet brugt til at vurdere, om disse forbindelser hæmmer den seksuelle udvikling af P. falciparum i Anopheles-myggen 17,18,19. Dette assay har fået anerkendelse siden 1970-1980'erne som guldstandarden til evaluering af transmissionsblokering20,21. Dette assay giver et billigere alternativ end andre assays såsom RT-qPCR, som kræver specialudstyr. Desuden er der ikke behov for patienter til at udføre forsøgene. Dette assay involverer også tilvejebringelse af gametocytinduceret blod til kvindelige myg, som derefter dissekeres for at vurdere, om oocystudvikling er til stede21. Dette muliggør gametocytkvantificering og påvisning af deformerede oocyster på grund af forbindelserne22. For at en forbindelse skal klassificeres som effektiv, skal prævalensen (andelen af myg, der har mindst en oocyst i midgut) og antallet af oocyster (intensitet) i myggen midgut evalueres for at vurdere infektionsinhibering 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

Malaria er fortsat en af de mest ødelæggende sygdomme på verdensplan, og til dato er den afrikanske region stadig ansvarlig for 94% af alle tilfælde på verdensplan. Denne parasitære sygdom kræver en protozoan parasit, en Anopheles mygvektor og en hvirveldyr vært. Anopheles-slægten omfatter mere end 500 arter, hvoraf 60 er kendt som vektorer af parasitten. Plasmodium-parasitslægten består af 250 arter, og 48 af disse er involveret i sygdomsoverførsel. Desuden har Plasmodium falciparum-parasitten bidraget til anslået 99,7% af malariatilfældene i Afrika syd for Sahara i de senere år. 
Gametocytter udgør en del af parasitens seksuelle stadium og indtages af den kvindelige myg ved fodring på en inficeret menneskelig vært. Yderligere udvikling af parasitten i myggen forbedres af gunstige miljøforhold i myggens midgut. Her finder fusionen af de kvindelige og mandlige gameter sted, og de bevægelige ookineter stammer fra. Ookineterne kommer ind i myggens midgutepitel, og modne ookineter danner oocyster, som igen producerer bevægelige sporozoitter. Disse sporozoitter migrerer til myggens spytkirtler og injiceres, da en myg tager et blodmåltid. 
Til lægemiddelopdagelsesformål blev myg kunstigt inficeret med gametocytinficeret blod i standardmembranfodringsanalysen (SMFA). For at opdage infektion i myggen og / eller for at vurdere effektiviteten af malariaforbindelser blev midguts af de kvindelige myg fjernet efter infektion og blev farvet med mercurochrome. Denne metode blev brugt til at forbedre den visuelle påvisning af oocyster under mikroskopet til nøjagtig bestemmelse af oocystprævalens og intensitet.

Det samlede antal kontrolprøver, der blev dissekeret, var 47, med en gennemsnitlig prævalens på 89% og en intensitet på 9,5 oocyster pr. midgut (tabel 1, som tidligere offentliggjort22). For forbindelsen MMV1581558 nåede prøvestørrelsen i alt 42 prøver med en 36% oocystprævalens og en gennemsnitlig intensitet på 1,5 oocyster. Dette viser en reduktion i oocystprævalensen på 58% og en TRA på 82% på tværs af alle tre biologiske replikater (tabel 1).</p...

Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Standardmembranfodringsanalysen (SMFA) betragtes som guldstandarden til vurdering og identifikation af potentielle malariaforbindelser. Dette kunstige fodringssystem bruges til at inficere myg for yderligere at evaluere virkningerne af sådanne forbindelser på intensiteten og forekomsten af Plasmodium falciparum-parasitten .

Standard membranfodringsanalyse til påvisning af Plasmodium falciparum-infektion i Anopheles mygvektorer

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Protokollen giver os mulighed for at påvise effekten af behandlingen på malariafølsomheden af afrikanske malariavektorer. For eksempel forbindelser, der sigter mod at blokere transmission fra mennesket til myggen. Denne teknik gør det muligt for forskere at evaluere et stort antal forbindelser under laboratoriebetingelser, selv før toksicitet GATEs er tilgængelige.Midgut dissektioner kan være udfordrende i starten, men det kræver bare lidt øvelse. At kunne identificere oocyster er heller ikke altid let. Først skal du bruge en mundaspirator til at placere 25 ufødte kvindelige Anopheles gambiae myg i en 350 milliliter fodringskop.Mærk kopperne tydeligt for at skelne mellem kontrol- og behandlingsgrupper. Vælg antallet af kopper pr. behandling i henhold til antallet af inkluderede tekniske replikater. Tilslut glasfødersystemet til et vandbad og hold temperaturen på 37 grader Celsius.Forbered derefter koens tarm eller syntetiske membran ved at skylle den i ledningsvand og skære den i stykker, der er monteret til hver feeder. Dæk den nederste del af hver feeder og fastgør membranen med et elastikbånd. For at bruge foderkopperne som infektionskopper skal du først holde membranen oven på koppernes net.Placer derefter infektionskopperne under fødefoderne. Tilsæt nu en milliliter gametocytinficeret blod til fodermidlerne til kontrolkopperne og gametocytinficeret blod med en testforbindelse til fødefoderne af behandlingskopperne. Lad derefter myggene fodre i ca. 40 minutter.Efter fodring skal du fjerne fødefoderne fra kopperne, skylle fødefoderne og behandle overskydende blod med hypochlorit. Bank derefter alle myggene ned på isen i et til to minutter, og vælg de myg, der har taget et blodmåltid ved at kigge efter hævede og røde maver. Udskift sukkervandet, der gives på alternative dage til hver infektionskop, med en 10% sukkervandpude, og inkuber infektionskopperne i et biosikkerhedskammer i otte til 10 dage.Otte til 10 dage efter fodring skal du slå de inficerede myg ned ved at placere dem på is. Overfør dem derefter til mærkede rør med 70% ethanol, og hold kontrol i hver behandlingsgruppe i separate rør. Hold kontrol- og testgrupperne adskilt, overfør myggene til mærkede petriskåle foret med filterpapir.Tilsæt en dråbe PBS på et passende mærket glasglas, og overfør en myg fra filterpapiret til dråben. Pin myggens brystkasse med dissekeringsnål. Fjern derefter midgut ved at trække det syvende abdominale segment med tang, og overfør det til en dråbe på 0,1% merkurokrom på et nyt mikroskopglas.Lad tarmen plette i otte til 10 minutter. Placer derefter en dæksel på den farvede tarm, og se den under lys feltbelysning ved 20 til 40 gange forstørrelse. Registrer antallet af oocyster pr. midgut for kontrollen og hver behandlingsgruppe.I denne undersøgelse viste det sig, at forbindelsen MMV1581558 signifikant begrænsede antallet af Plasmodium falciparum oocyster i midgut af kvindelige Anopheles gambiae myg i forhold til kontrollen. I kontrolgruppen var den gennemsnitlige forekomst af oocyster i midgut 89% med en gennemsnitlig intensitet på 9,5 oocyster pr. Midgut. Men i den MMV1581558 behandlede gruppe var den gennemsnitlige oocystprævalens 36% med en gennemsnitlig intensitet på kun 1,5 oocyster pr. Midgut.Således resulterede MMV1581558-behandling i 58% transmissionsblokerende aktivitet og 82% transmissionsreducerende aktivitet i alle tre biologiske replikater. Det er afgørende at sikre, at myg lever af en sund gametocytkultur. Hvis disse er umodne gametocytter eller ikke fase fem gametocytter, er sandsynligheden for at få en infektion i myggen begrænset eller umulig.Analysen bruger en visuel morfologisk identifikationsmetode, men molekylære kvantificeringsassays kan anvendes. Dette er dog dyrere og kan begrænse deres anvendelse i ressourcebegrænsede laboratorier. At have evnen til at udføre denne teknik åbner nye veje til at evaluere ændringen af malariaprævalens og intensitet mellem næsten alt i myg.For eksempel sammenligning af artsvektorkapacitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Valg af Plasmodium falciparum Parasitter for Cytoadhesion Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Samtidig infektion model for at studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions i humane primære Monocytafledte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protokol for Platelet-medieret sammenklumpning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Smittede Erythrocytes i en ressource Poor indstilling

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Oprensning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites Til brug i opsoniserende antistofanalyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder til undersøgelse af Regulatory rolle små RNA og Ribosomal Belægning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Måling naturligt erhvervet fagcytose-inducerende antistoffer mod plasmodium falciparum parasitter ved en Flow Cytometri-Baseret Analyse

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In vitro Analyse af plasmodiuminficerede røde blodlegemer ved cytotoksiske lymfocytter

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...