Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
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Les auteurs tiennent à remercierProf. Lyn-Mari Birkholtz et le Dr Janette Reader du Département de biochimie, génétique et microbiologie de l’Institut de lutte durable contre le paludisme de l’Université de Pretoria pour la culture et la fourniture de la culture de gamétocytes. La souche parasitaire a été obtenue auprès de ce dernier département (ne faisant pas partie de cette publication). Le Département de la science et de l’innovation (DSI) et la Fondation nationale de la recherche (NRF); Initiative des chaires de recherche sud-africaines (UID 64763 à LK et UID 84627 à LMB); les communautés de pratique de la NRF (UID 110666 à LMB et LK); et le South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) sont également reconnus pour les fonds du DSI.

Reportez-vous à la figure 1 pour une illustration du protocole. L’autorisation éthique a été obtenue du Comité d’éthique des sciences de la santé de l’Université de Pretoria (506/2018) pour le prélèvement et l’utilisation de sang humain.
1. Culture de gamétocytes
NOTE: Avant la mise en place de la SMFA, une culture de gamétocytes a été préparée à l’Université de Pretoria (voir Reader et <sup cl...

Pour que ce protocole soit exécuté avec succès, une attention particulière doit être accordée à chaque étape, même s’il peut s’agir d’un processus fastidieux et laborieux. L’une des étapes les plus importantes est de s’assurer que la culture des gamétocytes est de bonne qualité et qu’elle est constituée de gamétocytes matures, avec le bon ratio mâle/femelle, avant de commencer le SMFA23,24. Pendant la SMFA, il est également crucial de ...

Le paludisme, connu comme l’une des maladies les plus destructrices au monde, constitue toujours une grande menace pour plusieurs pays, en particulier ceux de la région africaine, et contribue à environ 95% des cas dans le monde1. Cette maladie est causée par un parasite protozoaire et, avec son moustique vecteur Anopheles, ces coupables peuvent causer de grands dommages à l’hôte humain2. Plus précisément, l’espèce falciparum du genre parasite Plasmodium est responsable d’environ 99% des cas de paludisme en Afrique subsaharienne1. En outre, plusieurs vecteurs majeurs de moustiques anophèles (y compris An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n., et An. funestus Giles) pourraient être blâmés pour plus de 95% de la transmission du parasite dans le monde 3,4,5,6,7,8 . Pour que la compagnie parasite-vecteur idéale soit établie, le moustique vecteur doit être sensible au parasite et être capable de le transmettre9. En outre, le vecteur et le parasite doivent surmonter les barrières physiques pour former la combinaison infectieuse parfaite - le moustique vecteur doit être capable de soutenir le développement du parasite, et le parasite doit avoir la capacité de surmonter les mécanismes de défense de l’hôte10,11.
Les gamétocytes, le stade sexuel du parasite P. falciparum, jouent un rôle crucial dans la connexion des partenaires vecteurs et parasites12. Le développement sexuel a lieu in vivo, et la gamétocytogenèse décrit le processus de différenciation des gamétocytes matures en microgamètes mâles mobiles et macrogamètes femelles13. Un autre processus qui a lieu à l’intérieur du moustique est l’exflagellation - le processus au cours duquel le gamétocyte mâle se transforme en gamètes et émerge des globules rouges absorbés lors d’un repas de sang11. Le processus d’exflagellation est en outre suggéré d’être amélioré par un changement favorable dans l’environnement de l’intestin moyendu moustique 14. Après exflagellation, un zygote est formé par la fusion des gamètes mâle et femelle13. Du zygote, un oocinète mobile apparaît et se déplace du repas de sang à l’épithélium de l’intestin moyen du moustique13. Ici, l’oocinète mûrit et un oocyste se forme, qui, à son tour, produit des sporozoïtes mobiles13,15. Les sporozoïtes migrent ensuite vers les glandes salivaires du moustique et, comme le moustique prend un repas de sang de son hôte, ces sporozoïtes sont injectés dans la circulation sanguine de l’hôte15.
Les interventions de lutte contre le paludisme, combinant des stratégies de lutte antivectorielle et l’utilisation de médicaments antipaludiques efficaces, sont devenues cruciales dans la lutte contre cette maladie15. Avec l’augmentation de la résistance aux parasites et aux moustiques, l’urgence d’identifier de nouveaux composés antipaludiques augmente16. Par conséquent, l’évaluation in vivo des composés bloquant la transmission est importante16. Après la mise au point de tels médicaments efficaces bloquant la transmission, le SMFA a été utilisé pour évaluer si ces composés inhibent le développement sexuel de P. falciparum chez le moustique anophèle 17,18,19. Ce test a été reconnu depuis les années 1970-1980 comme l’étalon-or pour évaluer le blocage de transmission20,21. Ce test offre une alternative moins chère que d’autres tests tels que la RT-qPCR, qui nécessite un équipement spécialisé. De plus, aucun patient n’est nécessaire pour exécuter les expériences. Ce test implique également l’apport de sang induit par les gamétocytes aux moustiques femelles, qui sont ensuite disséqués pour évaluer si le développement d’oocystes est présent21. Cela permet la quantification des gamétocytes et la détection des oocystes déformés à cause des composés22. Pour qu’un composé soit classé comme efficace, la prévalence (la proportion de moustiques qui hébergent au moins un oocyste dans l’intestin moyen) et le nombre d’oocystes (intensité) dans l’intestin moyen du moustique doivent être évalués pour évaluer l’inhibition de l’infection 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

Le paludisme reste l’une des maladies les plus dévastatrices au monde et, à ce jour, la Région africaine est toujours responsable de 94% de tous les cas dans le monde. Cette maladie parasitaire nécessite un parasite protozoaire, un moustique vecteur anophèle et un hôte vertébré. Le genre Anopheles comprend plus de 500 espèces, dont 60 sont connues comme vecteurs du parasite. Le genre de parasites Plasmodium comprend 250 espèces, dont 48 sont impliquées dans la transmission de maladies. En outre, le parasite Plasmodium falciparum a contribué à environ 99,7% des cas de paludisme en Afrique subsaharienne ces dernières années. 
Les gamétocytes font partie du stade sexuel du parasite et sont ingérés par le moustique femelle lorsqu’il se nourrit d’un hôte humain infecté. Le développement ultérieur du parasite dans le moustique est renforcé par des conditions environnementales favorables dans l’intestin moyen du moustique. Ici, la fusion des gamètes femelles et mâles a lieu, et les oocinètes mobiles sont originaires. Les oocinètes pénètrent dans l’épithélium de l’intestin moyen du moustique et les oocinètes matures forment des oocystes, qui, à leur tour, produisent des sporozoïtes mobiles. Ces sporozoïtes migrent vers les glandes salivaires du moustique et sont injectés lorsqu’un moustique prend un repas de sang. 
À des fins de découverte de médicaments, les moustiques ont été artificiellement infectés par du sang infecté par des gamétocytes dans le test standard d’alimentation par membrane (SMFA). Pour détecter l’infection chez le moustique et/ou évaluer l’efficacité des composés antipaludiques, l’intestin moyen des moustiques femelles a été enlevé après l’infection et a été coloré avec du mercurochrome. Cette méthode a été utilisée pour améliorer la détection visuelle des oocystes au microscope afin de déterminer avec précision la prévalence et l’intensité des oocystes.

Le nombre total d’échantillons témoins disséqués était de 47, avec une prévalence moyenne de 89 % et une intensité de 9,5 oocystes par intestin moyen (tableau 1, tel que publié précédemment22). Pour le composé MMV1581558, la taille de l’échantillon a atteint un total de 42 spécimens, avec une prévalence d’oocystes de 36% et une intensité moyenne de 1,5 oocystes. Cela montre une réduction de la prévalence des oocystes de 58% et une TRA de 82% dans les trois r...

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Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Le test standard d’alimentation membranaire (SMFA) est considéré comme l’étalon-or pour l’évaluation et l’identification de composés antipaludiques potentiels. Ce système d’alimentation artificiel est utilisé pour infecter les moustiques afin d’évaluer davantage les effets de ces composés sur l’intensité et la prévalence du parasite Plasmodium falciparum .

Dosage standard d’alimentation par membrane pour la détection de l’infection à Plasmodium falciparum chez les moustiques vecteurs anophèles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Le protocole nous permet de détecter l’effet du traitement sur la susceptibilité au paludisme des vecteurs africains du paludisme. Par exemple, des composés visant à bloquer la transmission de l’homme au moustique. Cette technique permet aux chercheurs d’évaluer un grand nombre de composés dans des conditions de laboratoire, avant même que les GATE de toxicité ne soient disponibles.Les dissections de l’intestin moyen peuvent être difficiles au début, mais il suffit de pratiquer. Aussi, pouvoir identifier les oocystes n’est pas toujours facile. Tout d’abord, à l’aide d’un aspirateur buccal, placez 25 moustiques femelles Anopheles gambiae non nourries dans une tasse d’alimentation de 350 millilitres.Étiquetez clairement les gobelets pour faire la distinction entre le groupe témoin et le groupe de traitement. Choisissez le nombre de tasses par traitement en fonction du nombre de répétitions techniques incluses. Connectez le système d’alimentation en verre à un bain-marie et maintenez la température à 37 degrés Celsius.Ensuite, préparez l’intestin de vache ou la membrane synthétique en le rinçant à l’eau du robinet et en le coupant en morceaux qui sont ajustés pour chaque mangeoire. Couvrez la partie inférieure de chaque chargeur et fixez la membrane avec une bande élastique. Pour utiliser les gobelets d’alimentation comme gobelets d’infection, gardez d’abord la membrane au-dessus des filets des tasses.Ensuite, placez les gobelets d’infection sous les mangeoires. Maintenant, ajoutez un millilitre de sang infecté par des gamétocytes aux mangeoires des gobelets témoins, et du sang infecté par des gamétocytes avec un composé de test aux mangeoires des gobelets de traitement. Ensuite, laissez les moustiques se nourrir pendant environ 40 minutes.Après l’alimentation, retirez les mangeoires des tasses, rincez les mangeoires et traitez l’excès de sang avec de l’hypochlorite. Ensuite, renversez tous les moustiques sur la glace pendant une à deux minutes et sélectionnez les moustiques qui ont pris un repas de sang en recherchant les abdomens enflés et rouges. Remplacez l’eau sucrée qui est donnée un jour sur deux à chaque tasse d’infection par un tampon d’eau sucrée à 10% et incuber les tasses d’infection dans une chambre de biosécurité pendant huit à 10 jours.Huit à 10 jours après l’alimentation, abattez les moustiques infectés en les plaçant sur de la glace. Ensuite, transférez-les dans des tubes marqués contenant 70% d’éthanol, en gardant le contrôle dans chaque groupe de traitement dans des tubes séparés. En gardant les groupes de contrôle et de test séparés, transférez les moustiques dans des boîtes de Petri étiquetées doublées de papier filtre.Ajoutez une goutte de PBS sur une lame de verre correctement marquée et transférez un moustique du papier filtre à la goutte. Épinglez le thorax du moustique avec une aiguille à disséquer. Ensuite, retirez l’intestin moyen en tirant le septième segment abdominal avec une pince et transférez-le dans une gouttelette de mercurochrome à 0,1% sur une nouvelle lame de microscope.Laissez l’intestin tacher pendant huit à 10 minutes. Ensuite, placez un couvercle sur l’intestin taché et visualisez-le sous éclairage en champ clair à un grossissement de 20 à 40 fois. Notez le nombre d’oocystes par intestin moyen pour le groupe témoin et chaque groupe de traitement.Dans cette étude, le composé MMV1581558 s’est avéré limiter de manière significative le nombre d’oocystes de Plasmodium falciparum dans l’intestin moyen des moustiques femelles Anopheles gambiae par rapport au témoin. Dans le groupe témoin, la prévalence moyenne des oocystes dans l’intestin moyen était de 89% avec une intensité moyenne de 9,5 oocystes par intestin moyen. Mais dans le groupe traité par MMV1581558, la prévalence moyenne des oocystes était de 36% avec une intensité moyenne de seulement 1,5 oocyste par intestin moyen.Ainsi, le traitement par MMV1581558 a entraîné une activité de blocage de transmission de 58% et une activité de réduction de transmission de 82% dans les trois réplicats biologiques. Il est essentiel de s’assurer que les moustiques se nourrissent d’une culture de gamétocytes saine. S’il s’agit de gamétocytes immatures ou de gamétocytes de stade cinq, la probabilité de contracter une infection chez le moustique est limitée, voire impossible.Le test utilise une méthode d’identification morphologique visuelle, mais des tests de quantification moléculaire peuvent être utilisés. Cela est toutefois plus coûteux et pourrait limiter leur utilisation dans les laboratoires aux ressources limitées. Avoir la capacité de faire cette technique ouvre de nouvelles voies pour évaluer le changement de la prévalence et de l’intensité du paludisme entre presque tout ce qui se trouve chez les moustiques.Par exemple, comparer la capacité vectorielle des espèces.

Research

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