Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לפרופ'. לין-מארי בירקהולץ וד"ר ג'נט רידר מהמחלקה לביוכימיה, גנטיקה ומיקרוביולוגיה, המכון לבקרת מלריה בת קיימא, באוניברסיטת פרטוריה, על גידול ואספקת תרבות הגמטוציטים. זן הטפיל התקבל מהמחלקה האחרונה (לא חלק מפרסום זה). המחלקה למדע וחדשנות (DSI) וקרן המחקר הלאומית (NRF); יוזמת כסאות מחקר בדרום אפריקה (UID 64763 ל- LK ו- UID 84627 ל- LMB); קהילות הנוהג של NRF (UID 110666 ל- LMB ו- LK); ושותפויות החדשנות האסטרטגית בתחום הבריאות של מועצת המחקר הרפואי של דרום אפריקה (SHIP) מוכרות גם הן עבור כספים מה-DSI.

עיין באיור 1 להמחשה של הפרוטוקול. אישור אתי התקבל מוועדת האתיקה למדעי הבריאות של אוניברסיטת פרטוריה (506/2018) לנסיגה ושימוש בדם אנושי.
1. תרבות הגמטוציטים
הערה: לפני הקמת ה- SMFA, הוכנה תרבות גמטוציטים באוניברסיטת פרטוריה (ראה Reader et <sup class="xref"...

כדי שפרוטוקול זה יבוצע בהצלחה, יש לתת תשומת לב לכל שלב, למרות שזה עשוי להיות תהליך מייגע ומייגע. אחד הצעדים החשובים ביותר הוא להבטיח כי תרבות gametocyte הוא באיכות טובה וכי הוא מורכב gametocytes בוגרים, עם יחס זכר:נקבה הנכון, לפני תחילת SMFA23,24. במהלך ה-SMFA, חשוב גם לשמור על ...

מלריה, הידועה כאחת המחלות ההרסניות ביותר בעולם, עדיין מהווה איום גדול על מספר מדינות - במיוחד אלה באזור אפריקה - ותורמת לכ-95% מהמקרים ברחבי העולם1. מחלה זו נגרמת על ידי טפיל פרוטוזואי, יחד עם וקטור יתוש Anopheles שלה, האשמים האלה יכולים לגרום נזק רב המארח האנושי2. ליתר דיוק, המין falciparum של סוג טפיל פלסמודיום אחראי על כ 99% ממקרי המלריה באפריקה שמדרום לסהרה1. בנוסף לכך, ניתן להאשים מספר וקטורים עיקריים של יתושי אנופלס (כולל An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n., ו- An. funestus Giles) ביותר מ-95% מהעברת הטפילים ברחבי העולם 3,4,5,6,7,8 . כדי להקים את החברות האידיאלית של טפיל-וקטור, וקטור היתוש צריך להיות רגיש לטפיל ולהיות מסוגל להעביר אותו9. יתר על כן, גם הווקטור וגם הטפיל צריכים להתגבר על מחסומים פיזיים כדי ליצור את השילוב הזיהומי המושלם - וקטור היתוש צריך להיות מסוגל לקיים את התפתחות הטפיל, והטפיל צריך להיות בעל יכולת להתגבר על מנגנוני ההגנה של הפונדקאי10,11.
גמטוציטים, השלב המיני של טפיל P. falciparum, ממלאים תפקיד מכריע בחיבור בין השותפים הווקטוריים והטפילים12. ההתפתחות המינית מתרחשת in vivo, וגמטוציטוגנזה מתארת את תהליך ההתמיינות של גמטוציטים בוגרים למיקרוגמטות זכריות תנועתיות ומקרוגמטות נקביות13. תהליך נוסף המתרחש בתוך היתוש הוא exflagellation - התהליך שבמהלכו הגמטוציט הזכרי הופך לגמטות ומגיח מתוך תאי הדם האדומים שנלקחו במהלך ארוחת דם11. תהליך ההסתגרות מוצע עוד יותר להיות משופר על ידי שינוי חיובי בסביבה של יתוש midgut14. לאחר exflagellation, זיגוטה נוצרת על ידי מיזוג של גמטות זכר ונקבה13. מן הזיגוטה, אוקינט תנועתי עולה ועובר מארוחת הדם לאפיתל של היתוש midgut13. כאן, ookinete מתבגר, ו oocyst נוצר, אשר, בתורו, מייצר sporozoites תנועתי13,15. לאחר מכן הספורוזואיטים נודדים לבלוטות הרוק של היתושים, וכאשר היתוש לוקח ארוחת דם מהפונדקאי שלו, ספורוזואיטים אלה מוזרקים לזרם הדם של הפונדקאי15.
התערבויות בקרת מלריה, המשלבות אסטרטגיות בקרת וקטורים ושימוש בתרופות יעילות נגד מלריה, הפכו חיוניות במאבק במחלה זו15. עם העלייה בעמידות בפני טפילים ויתושים, הדחיפות לזיהוי תרכובות חדשות נגד מלריה עולהב-16. לכן, הערכת in vivo של תרכובות חוסמות שידור חשובה16. לאחר פיתוח של תרופות חוסמות העברה יעילות כאלה, SMFA שימש כדי להעריך אם תרכובות אלה מעכבות את ההתפתחות המינית של P. falciparum יתוש Anopheles 17,18,19. בדיקה זו זכתה להכרה מאז שנות ה-70 וה-80 של המאה ה-20 כתקן הזהב להערכת חסימת תמסורת20,21. בדיקה זו מספקת אלטרנטיבה זולה יותר מאשר בדיקות אחרות כגון RT-qPCR, הדורשת ציוד מיוחד. יתר על כן, אין צורך בחולים כדי לבצע את הניסויים. בדיקה זו כוללת גם מתן דם המושרה על ידי גמטוציטים ליתושים נקבות, אשר מנותחים לאחר מכן כדי להעריך אם התפתחות oocyst קיים21. זה מאפשר כימות גמטוציטים וזיהוי של oocysts מעוותים בגלל תרכובות22. כדי שתרכובת תסווג כיעילה, יש להעריך את השכיחות (שיעור היתושים שיש להם לפחות אוציסט אחד באמצע המעיים) ואת מספר האוציסטים (עוצמה) במידגוט היתושים כדי להעריך את עיכוב הזיהום 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

מלריה נותרה אחת המחלות ההרסניות ביותר בעולם, ועד כה, האזור האפריקאי עדיין אחראי ל -94% מכלל המקרים ברחבי העולם. מחלה טפילית זו דורשת טפיל פרוטוזואי, וקטור יתוש אנופלס ופונדקאי בעל חוליות. הסוג אנופלס כולל יותר מ -500 מינים, מתוכם 60 ידועים כווקטורים של הטפיל. הסוג טפיל פלסמודיום מורכב מ-250 מינים, ו-48 מהם מעורבים בהעברת מחלות. יתר על כן, טפיל הפלסמודיום פלציפרום תרם בשנים האחרונות לכ-99.7% ממקרי המלריה באפריקה שמדרום לסהרה. 
גמטוציטים מהווים חלק מהשלב המיני של הטפיל והם נבלעים על ידי נקבת היתוש כאשר הם ניזונים מפונדקאי אנושי נגוע. התפתחות נוספת של הטפיל בתוך היתוש משופרת על ידי תנאים סביבתיים נוחים באמצע היתוש. כאן מתרחש המיזוג של הגמטות הנקביות והזכריות, ומקורם של האוקינטים התנועתיים. האוקינטים נכנסים לאפיתל midgut של היתוש, ואוקינטים בוגרים יוצרים oocysts, אשר, בתורם, מייצרים ספורוזואיטים תנועתיים. ספורוזואיטים אלה נודדים לבלוטות הרוק של היתוש ומוזרקים כאשר יתוש לוקח ארוחת דם. 
למטרות גילוי תרופות, יתושים הודבקו באופן מלאכותי בדם נגוע בגמטוציטים בבדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA). כדי לזהות זיהום בתוך היתוש ו/או כדי להעריך את היעילות של תרכובות נגד מלריה, הוסרו היתושים של נקבות היתושים לאחר ההדבקה והוכתמו במרקורוכרום. שיטה זו שימשה כדי לשפר את הזיהוי החזותי של oocysts תחת מיקרוסקופ לקביעה מדויקת של שכיחות oocyst ועוצמה.

המספר הכולל של דגימות הבקרה שנותחו היה 47, עם שכיחות ממוצעת של 89% ועוצמה של 9.5 oocysts לכל midgut (טבלה 1, כפי שפורסם קודםלכן 22). עבור התרכובת MMV1581558, גודל המדגם הגיע לסך של 42 דגימות, עם שכיחות של 36% oocyst ועוצמה ממוצעת של 1.5 oocysts. זה מראה ירידה בשכיחות oocyst של 58% ו- TRA של 82% על פני כל שלושת ...

Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

הפרוטוקול מאפשר לנו לזהות את השפעת הטיפול על הרגישות למלריה של וקטורים למלריה אפריקאית. לדוגמה, תרכובות שמטרתן לחסום את ההעברה מהאדם ליתוש. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להעריך מספר רב של תרכובות בתנאי מעבדה, עוד לפני ש-GATEs רעילים זמינים.נתיחות מידגוט יכולות להיות מאתגרות בהתחלה, אבל זה פשוט דורש קצת תרגול. כמו כן, כדי להיות מסוגל לזהות oocysts לא תמיד קל. ראשית, באמצעות שואב פה, הכניסו 25 יתושי Anopheles gambiae נקבות לא מזוהמות לכוס האכלה של 350 מיליליטר.יש לסמן את הכוסות בצורה ברורה כדי להבחין בין קבוצת הביקורת לבין קבוצות הטיפול. בחר את מספר הכוסות לכל טיפול בהתאם למספר המשכפלים הטכניים הכלולים. חבר את מערכת הזנת הזכוכית לאמבטיית מים ושמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הכינו את המעי של הפרה או את הממברנה הסינתטית על ידי שטיפתה במי ברז וחתכתם לחתיכות המותאמות לכל מזין. מכסים את החלק התחתון של כל מזין ומהדקים את הממברנה עם רצועה אלסטית. לשימוש בכוסות ההזנה ככוסות זיהום, ראשית, יש לשמור את הממברנה על גבי רשתות הכוסות.לאחר מכן הניחו את כוסות הזיהום מתחת למאכילים. כעת, הוסף מיליליטר אחד של דם נגוע בגמטוציטים למזיני כוסות הבקרה, ודם נגוע בגמטוציטים עם תרכובת בדיקה למזיני כוסות הטיפול. ואז להשאיר את היתושים להאכיל במשך כ 40 דקות.לאחר ההאכלה, להסיר את המזינים מן הכוסות, לשטוף את המאכילים, ולטפל הדם עודף עם hypochlorite. לאחר מכן, הפילו את כל היתושים על הקרח למשך דקה עד שתיים, ובחרו את היתושים שלקחו ארוחת דם על ידי חיפוש בטן נפוחה ואדומה. החליפו את מי הסוכר הניתנים בימים חלופיים לכל זיהום בפד מים של 10% סוכר, ודגרו את כוסות הזיהום בתא בטיחות ביולוגית למשך שמונה עד עשרה ימים.שמונה עד עשרה ימים לאחר ההאכלה, הפילו את היתושים הנגועים על ידי הנחתם על קרח. לאחר מכן, העבר אותם לצינורות מסומנים עם 70% אתנול, תוך שמירה על שליטה בכל קבוצת טיפול בצינורות נפרדים. תוך שמירה על הפרדה בין קבוצות הבקרה והבדיקה, העבירו את היתושים לצלחות פטרי מסומנות מרופדות בנייר סינון.הוסיפו טיפה של PBS על מגלשת זכוכית המסומנת כראוי, והעבירו יתוש מנייר הסינון אל הטיפה. להצמיד את בית החזה של היתוש עם מחט לנתח. לאחר מכן, הסר את midgut על ידי משיכת קטע הבטן השביעי עם מלקחיים, ולהעביר אותו טיפה של 0.1% mercurochrome על שקופית מיקרוסקופ חדש.השאירו את המעיים להכתים במשך שמונה עד 10 דקות. לאחר מכן הניחו כיסוי על המעיים המוכתמים, וצפו בו תחת תאורת שדה בהירה בהגדלה של פי 20 עד 40. רשום את מספר oocysts לכל midgut עבור הבקרה וכל קבוצת טיפול.במחקר זה, התרכובת MMV1581558 נמצאה כמגבילה באופן משמעותי את מספר הפלסמודיום falciparum oocysts באמצע היתושים של נקבות אנופלס גמביה בהשוואה לבקרה. בקבוצת הביקורת, השכיחות הממוצעת של oocysts במידגוט הייתה 89% עם עוצמה ממוצעת של 9.5 oocysts לכל midgut. אבל בקבוצה שטופלה ב-MMV1581558, השכיחות הממוצעת של oocysts הייתה 36% עם עוצמה ממוצעת של 1.5 oocysts בלבד לכל midgut.לפיכך, טיפול MMV1581558 הביא לפעילות חסימת שידור של 58% והפחתה של 82% בפעילות בכל שלושת המשכפלים הביולוגיים. זה קריטי כדי להבטיח כי יתושים להאכיל על תרבית gametocyte בריא. אם אלה הם גמטוציטים לא בשלים, או לא שלב חמש gametocytes, ההסתברות לקבל זיהום יתוש הוא מוגבל או בלתי אפשרי.הבדיקה משתמשת בשיטת זיהוי מורפולוגית חזותית, אולם ניתן להשתמש במבחני כימות מולקולריים. עם זאת, הדבר יקר יותר ועלול להגביל את השימוש בהם במעבדות מוגבלות במשאבים. היכולת לבצע טכניקה זו פותחת אפיקים חדשים להעריך את השינוי בשכיחות ובעוצמה של מלריה בין כמעט כל דבר אצל יתושים.לדוגמה, השוואת יכולת וקטורית של מינים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

הפרדה<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...