Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
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Gli autori ringraziano il Prof. Lyn-Mari Birkholtz e la dottoressa Janette Reader del Dipartimento di Biochimica, Genetica e Microbiologia, Istituto per il controllo sostenibile della malaria, presso l'Università di Pretoria, per la coltura e la fornitura della coltura dei gametociti. Il ceppo parassita è stato ottenuto da quest'ultimo dipartimento (non parte di questa pubblicazione). Il Dipartimento di Scienza e Innovazione (DSI) e la Fondazione Nazionale della Ricerca (NRF); South African Research Chairs Initiative (UID 64763 a LK e UID 84627 a LMB); le NRF Communities of Practice (UID 110666 a LMB e LK); e il South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) sono anche riconosciuti per i fondi del DSI.

Fare riferimento alla Figura 1 per un'illustrazione del protocollo. L'autorizzazione etica è stata ottenuta dal Comitato etico delle scienze della salute dell'Università di Pretoria (506/2018) per il ritiro e l'uso del sangue umano.
1. Cultura dei gametociti
NOTA: Prima di impostare l'SMFA, è stata preparata una coltura di gametociti presso l'Università di Pretoria (vedi Reader et al.22 per il ...

Affinché questo protocollo venga eseguito correttamente, è necessario prestare attenzione a ogni passaggio, anche se potrebbe essere un processo noioso e laborioso. Uno dei passi più importanti è assicurarsi che la coltura dei gametociti sia di buona qualità e che sia costituita da gametociti maturi, con il corretto rapporto maschio/femmina, prima di iniziare l'SMFA23,24. Durante la SMFA, è anche fondamentale mantenere la coltura dei gametociti alla tempera...

La malaria, conosciuta come una delle malattie più distruttive in tutto il mondo, rappresenta ancora una grande minaccia per diversi paesi, specialmente quelli all'interno della regione africana, e contribuisce a circa il 95% dei casi in tutto il mondo1. Questa malattia è causata da un parassita protozoo e, insieme al suo vettore di zanzara Anopheles, questi colpevoli possono causare gravi danni all'ospite umano2. Più specificamente, la specie falciparum del genere parassita Plasmodium è responsabile di circa il 99% dei casi di malaria nell'Africa sub-sahariana1. Oltre a questo, diversi importanti vettori di zanzare Anopheles (tra cui An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. e An. funestus Giles) potrebbero essere accusati di oltre il 95% della trasmissione dei parassiti a livello globale 3,4,5,6,7,8 . Affinché sia stabilita la compagnia ideale parassita-vettore, il vettore di zanzara dovrebbe essere suscettibile al parassita ed essere in grado di trasmetterlo9. Inoltre, sia il vettore che il parassita dovrebbero superare le barriere fisiche per formare la perfetta combinazione infettiva: il vettore di zanzara dovrebbe essere in grado di sostenere lo sviluppo del parassita e il parassita dovrebbe avere la capacità di superare i meccanismi di difesa dell'ospite10,11.
I gametociti, lo stadio sessuale del parassita P. falciparum, svolgono un ruolo cruciale nel collegare il vettore e i partner del parassita12. Lo sviluppo sessuale avviene in vivo e la gametocitogenesi descrive il processo di differenziazione dei gametociti maturi in microgameti maschili mobili e macrogameti femminili13. Un altro processo che avviene all'interno della zanzara è l'esflagellazione, il processo durante il quale il gametocita maschile si trasforma in gameti ed emerge dai globuli rossi assorbiti durante un pasto di sangue11. Il processo di esflagellazione è ulteriormente suggerito per essere migliorato da un cambiamento favorevole nell'ambiente della zanzara midgut14. Dopo l'esflagellazione, uno zigote è formato dalla fusione dei gameti maschili e femminili13. Dallo zigote, un ookinete mobile sorge e si sposta dal pasto di sangue all'epitelio della zanzara midgut13. Qui matura l'ookinete e si forma una oocisti che, a sua volta, produce sporozoiti mobili13,15. Gli sporozoiti migrano quindi verso le ghiandole salivari della zanzara e, mentre la zanzara prende un pasto di sangue dal suo ospite, questi sporozoiti vengono iniettati nel flusso sanguigno dell'ospite15.
Gli interventi di controllo della malaria, che combinano strategie di controllo dei vettori e l'uso di farmaci antimalarici efficaci, sono diventati cruciali nella lotta contro questa malattia15. Con l'aumento della resistenza ai parassiti e alle zanzare, l'urgenza per l'identificazione di nuovi composti antimalarici sta aumentando16. Pertanto, la valutazione in vivo dei composti che bloccano la trasmissione è importante16. Dopo lo sviluppo di tali efficaci farmaci che bloccano la trasmissione, l'SMFA è stato utilizzato per valutare se questi composti inibiscono lo sviluppo sessuale di P. falciparum nella zanzara Anopheles 17,18,19. Questo test ha ottenuto il riconoscimento dal 1970-1980 come il gold standard per valutare il blocco della trasmissione20,21. Questo test fornisce un'alternativa più economica rispetto ad altri test come RT-qPCR, che richiede attrezzature specializzate. Inoltre, non sono necessari pazienti per eseguire gli esperimenti. Questo test prevede anche la fornitura di sangue indotto da gametociti alle zanzare femmine, che vengono poi sezionate per valutare se lo sviluppo di oocisti è presente21. Ciò consente la quantificazione dei gametociti e l'individuazione di oocisti deformate a causa dei composti22. Affinché un composto sia classificato come efficace, la prevalenza (la proporzione di zanzare che ospitano almeno una oocisti nel midgut) e il numero di oocisti (intensità) nel midgut della zanzara devono essere valutati per valutare l'inibizione dell'infezione 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

La malaria rimane una delle malattie più devastanti in tutto il mondo e, ad oggi, la regione africana è ancora responsabile del 94% di tutti i casi in tutto il mondo. Questa malattia parassitaria richiede un parassita protozoo, un vettore di zanzara Anopheles e un ospite vertebrato. Il genere Anopheles comprende più di 500 specie, di cui 60 sono conosciute come vettori del parassita. Il genere Plasmodium parasite comprende 250 specie e 48 di queste sono coinvolte nella trasmissione della malattia. Inoltre, il parassita Plasmodium falciparum ha contribuito a circa il 99,7% dei casi di malaria nell'Africa sub-sahariana negli ultimi anni. 
I gametociti fanno parte dello stadio sessuale del parassita e vengono ingeriti dalla zanzara femmina dopo essersi nutriti di un ospite umano infetto. L'ulteriore sviluppo del parassita all'interno della zanzara è migliorato da condizioni ambientali favorevoli nel midgut della zanzara. Qui avviene la fusione dei gameti femminili e maschili e hanno origine gli oocineti mobili. Gli oocineti entrano nell'epitelio intestinale medio della zanzara e gli oocinesiti maturi formano oocisti, che a loro volta producono sporozoiti mobili. Questi sporozoiti migrano verso le ghiandole salivari della zanzara e vengono iniettati come una zanzara prende un pasto di sangue. 
Ai fini della scoperta di farmaci, le zanzare sono state infettate artificialmente con sangue infetto da gametociti nel test standard di alimentazione a membrana (SMFA). Per rilevare l'infezione all'interno della zanzara e / o per valutare l'efficacia dei composti antimalarici, le viscere intermedie delle zanzare femmine sono state rimosse dopo l'infezione e sono state colorate con mercurocromo. Questo metodo è stato utilizzato per migliorare la rilevazione visiva delle oocisti al microscopio per la determinazione accurata della prevalenza e dell'intensità delle oocisti.

Il numero totale di campioni di controllo sezionati era di 47, con una prevalenza media dell'89% e un'intensità di 9,5 oocisti per intestino medio (Tabella 1, pubblicata in precedenza22). Per il composto MMV1581558, la dimensione del campione ha raggiunto un totale di 42 campioni, con una prevalenza di oocisti del 36% e un'intensità media di 1,5 oocisti. Ciò mostra una riduzione della prevalenza di oocisti del 58% e una TRA dell'82% in tutte e tre le repliche biologiche (<stron...

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Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Il test standard di alimentazione a membrana (SMFA) è considerato il gold standard per la valutazione e l'identificazione di potenziali composti antimalarici. Questo sistema di alimentazione artificiale viene utilizzato per infettare le zanzare per valutare ulteriormente gli effetti di tali composti sull'intensità e la prevalenza del parassita Plasmodium falciparum .

Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Il protocollo ci permette di rilevare l'effetto del trattamento sulla suscettibilità alla malaria dei vettori africani della malaria. Ad esempio, composti volti a bloccare la trasmissione dall'uomo alla zanzara. Questa tecnica consente ai ricercatori di valutare un gran numero di composti in condizioni di laboratorio, anche prima che siano disponibili GATE di tossicità.Le dissezioni dell'intestino medio possono essere difficili all'inizio, ma ci vuole solo un po 'di pratica. Inoltre, essere in grado di identificare le oocisti non è sempre facile. In primo luogo, utilizzando un aspiratore a bocca, posizionare 25 zanzare Anopheles gambiae femmine non alimentate in una tazza da 350 millilitri.Etichettare chiaramente le coppette per distinguere tra gruppi di controllo e di trattamento. Scegli il numero di tazze per trattamento in base al numero di repliche tecniche incluse. Collegare il sistema di alimentazione del vetro a bagnomaria e mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius.Quindi, preparare l'intestino di mucca o la membrana sintetica sciacquandolo in acqua di rubinetto e tagliandolo in pezzi che sono montati per ogni alimentatore. Coprire la parte inferiore di ciascun alimentatore e fissare la membrana con un elastico. Per utilizzare le tazze di alimentazione come coppette di infezione, in primo luogo, mantenere la membrana sopra le reti delle tazze.Quindi posizionare le coppe di infezione sotto gli alimentatori. Ora, aggiungi un millilitro di sangue infetto da gametociti agli alimentatori delle coppe di controllo e sangue infetto da gametociti con un composto di prova agli alimentatori delle coppe di trattamento. Quindi lasciare le zanzare a nutrirsi per circa 40 minuti.Dopo l'alimentazione, rimuovere gli alimentatori dalle tazze, sciacquare gli alimentatori e trattare il sangue in eccesso con ipoclorito. Quindi, abbatti tutte le zanzare sul ghiaccio per uno o due minuti e seleziona le zanzare che hanno preso un pasto di sangue cercando addomi gonfi e rossi. Sostituire l'acqua zuccherata che viene somministrata a giorni alterni a ciascuna tazza di infezione con un tampone di acqua zuccherata al 10% e incubare le coppette di infezione in una camera di biosicurezza per otto o 10 giorni.Da otto a 10 giorni dopo l'alimentazione, abbatti le zanzare infette mettendole sul ghiaccio. Quindi, trasferirli in tubi etichettati con etanolo al 70%, mantenendo il controllo in ciascun gruppo di trattamento in provette separate. Mantenendo separati i gruppi di controllo e di test, trasferire le zanzare in piastre di Petri etichettate rivestite con carta da filtro.Aggiungere una goccia di PBS su un vetrino opportunamente contrassegnato e trasferire una zanzara dalla carta da filtro alla goccia. Appuntare il torace della zanzara con l'ago da dissezione. Quindi, rimuovere l'intestino medio tirando il settimo segmento addominale con una pinza e trasferirlo in una goccia di mercurocromo allo 0,1% su un nuovo vetrino da microscopio.Lasciare macchiare l'intestino per otto-10 minuti. Quindi posizionare una pellicola di copertura sull'intestino macchiato e visualizzarlo sotto l'illuminazione a campo luminoso da 20 a 40 volte l'ingrandimento. Registrare il numero di oocisti per intestino medio per il controllo e ciascun gruppo di trattamento.In questo studio, il composto MMV1581558 è stato trovato per limitare significativamente il numero di oocisti Plasmodium falciparum nell'intestino medio delle zanzare femmine di Anopheles gambiae rispetto al controllo. Nel gruppo di controllo, la prevalenza media di oocisti nel midgut era dell'89% con un'intensità media di 9,5 oocisti per midgut. Ma nel gruppo trattato con MMV1581558, la prevalenza media delle oocisti era del 36% con un'intensità media di solo 1,5 oocisti per intestino medio.Pertanto, il trattamento con MMV1581558 ha determinato un'attività di blocco della trasmissione del 58% e un'attività di riduzione della trasmissione dell'82% in tutte e tre le repliche biologiche. È fondamentale garantire che le zanzare si nutrano di una coltura di gametociti sana. Se questi sono gametociti immaturi o non stadiociti al quinto stadio, la probabilità di contrarre un'infezione nella zanzara è limitata o impossibile.Il test utilizza un metodo di identificazione morfologica visiva, tuttavia è possibile utilizzare saggi di quantificazione molecolare. Questo è, tuttavia, più costoso e potrebbe limitare il loro uso in laboratori con risorse limitate. Avere la capacità di fare questa tecnica apre nuove strade per valutare il cambiamento della prevalenza e dell'intensità della malaria tra quasi tutto nella zanzara.Ad esempio, confrontando la capacità vettoriale delle specie.

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