Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenneProf. Lyn-Mari Birkholtz og Dr. Janette Reader fra Institutt for biokjemi, genetikk og mikrobiologi, Institutt for bærekraftig malariakontroll, ved Universitetet i Pretoria, for dyrking og forsyning av gametocytkulturen. Parasittstammen ble hentet fra sistnevnte avdeling (ikke en del av denne publikasjonen). Institutt for naturvitenskap og innovasjon (DSI) og National Research Foundation (NRF); South African Research Chairs Initiative (UID 64763 til LK og UID 84627 til LMB); NRF Communities of Practice (UID 110666 til LMB og LK); og South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) er også anerkjent for midler fra DSI.

Se figur 1 for en illustrasjon av protokollen. Etisk klarering ble innhentet fra University of Pretoria Health Sciences Ethics Committee (506/2018) for tilbaketrekking og bruk av humant blod.
1. Gametocytkultur
MERK: Før etableringen av SMFA ble det utarbeidet en gametocytkultur ved Universitetet i Pretoria (se Reader et al.22 for hele protokollen).
<ol><li>Forbered en gametocytkultur som best...

For at denne protokollen skal utføres vellykket, bør det tas hensyn til hvert trinn, selv om det kan være en kjedelig og arbeidskrevende prosess. Et av de viktigste trinnene er å sikre at gametocytkulturen er av god kvalitet og at den består av modne gametocytter, med riktig mann:kvinne-forhold, før man starter SMFA23,24. Under SMFA er det også avgjørende å opprettholde gametocytkulturen ved riktig temperatur for å forhindre at mannlige kjønnsceller ek...

Malaria, kjent som en av de mest ødeleggende sykdommene over hele verden, utgjør fortsatt en stor trussel mot flere land - spesielt de i den afrikanske regionen - og bidrar til omtrent 95% av tilfellene over hele verden. Denne sykdommen er forårsaket av en protozoan parasitt, og sammen med sin Anopheles myggvektor kan disse skyldige forårsake stor skade på den menneskelige verten2. Nærmere bestemt er falciparum-artene i Plasmodium-parasitten ansvarlig for anslagsvis 99% av malariatilfellene i Afrika sør for Sahara1. I tillegg til dette kan flere store Anopheles myggvektorer (inkludert An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee &Wilkerson sp.n., og An. funestus Giles) klandres for mer enn 95% av parasittoverføring globalt 3,4,5,6,7,8 . For at det ideelle parasittvektorkammeratet skal etableres, bør myggvektoren være utsatt for parasitten og kunne overføre den9. Videre bør både vektoren og parasitten overvinne fysiske barrierer for å danne den perfekte infeksjonskombinasjonen - myggvektoren skal kunne opprettholde parasittutvikling, og parasitten skal ha evnen til å overvinne vertens forsvarsmekanismer10,11.
Gametocytter, det seksuelle stadiet av P. falciparum-parasitten, spiller en avgjørende rolle i å koble vektor- og parasittpartnerne12. Seksuell utvikling foregår in vivo, og gametocytogenese beskriver prosessen med differensiering av modne gametocytter til motile mannlige mikrogameter og kvinnelige makrogameter13. En annen prosess som foregår i myggen er eksflagellasjon - prosessen der den mannlige gametocytten forvandles til gameter og kommer fra de røde blodcellene som tas opp under et blodmåltid11. Eksflagellasjonsprosessen foreslås videre å bli forbedret av en gunstig endring i myggens miljømidgut 14. Etter eksflagellasjon dannes en zygote ved fusjon av mannlige og kvinnelige gameter13. Fra zygoten oppstår en motil ookinete og beveger seg fra blodmelet til epitelet av mygg midgut13. Her modnes ookinete, og en oocyst dannes, som igjen produserer motile sporozoitter13,15. Sporozoittene migrerer deretter til myggens spyttkjertler, og når myggen tar et blodmåltid fra verten, injiseres disse sporozoittene i vertens blodstrøm15.
Malariakontrollintervensjoner, som kombinerer vektorkontrollstrategier og bruk av effektive antimalariamidler, har blitt avgjørende for å bekjempe denne sykdommen15. Med en økning i parasitt- og myggresistens øker haster for identifisering av nye antimalariale forbindelser16. Derfor er in vivo-evalueringen av transmisjonsblokkerende forbindelser viktig16. Etter utviklingen av slike effektive overføringsblokkerende legemidler har SMFA blitt brukt til å vurdere om disse forbindelsene hemmer den seksuelle utviklingen av P. falciparum i Anopheles-myggen 17,18,19. Denne analysen har fått anerkjennelse siden 1970-1980-tallet som gullstandarden for evaluering av overføringsblokkering20,21. Denne analysen gir et billigere alternativ enn andre analyser som RT-qPCR, som krever spesialutstyr. Videre er det ikke nødvendig med pasienter for å utføre forsøkene. Denne analysen innebærer også tilførsel av gametocytt-indusert blod til kvinnelige mygg, som deretter dissekeres for å vurdere om oocystutvikling er tilstede21. Dette muliggjør kvantifisering av gametocytter og påvisning av deformerte oocytter på grunn av forbindelsene22. For at en forbindelse skal klassifiseres som effektiv, må prevalensen (andelen mygg som har minst en oocyst i midttarmen) og antall oocyster (intensitet) i myggen midttarmen evalueres for å vurdere infeksjonshemming 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

Malaria er fortsatt en av de mest ødeleggende sykdommene over hele verden, og til dags dato er den afrikanske regionen fortsatt ansvarlig for 94% av alle tilfeller over hele verden. Denne parasittiske sykdommen krever en protozoparasitt, en Anopheles myggvektor og en vertebratvert. Anopheles-slekten består av mer enn 500 arter, hvorav 60 er kjent som vektorer av parasitten. Plasmodiumparasittslekten består av 250 arter, og 48 av disse er involvert i sykdomsoverføring. Videre har parasitten Plasmodium falciparum bidratt til anslagsvis 99,7% av malariatilfellene i Afrika sør for Sahara de siste årene. 
Gametocytter er en del av det seksuelle stadiet av parasitten og inntas av den kvinnelige myggen ved fôring på en infisert menneskelig vert. Videre utvikling av parasitten i mygget forbedres av gunstige miljøforhold i myggens midttarm. Her foregår fusjonen av kvinnelige og mannlige gameter, og de motile ookinetene oppstår. Ookinetene kommer inn i myggens midgutepitel, og modne ookineter danner oocyster, som igjen produserer motile sporozoitter. Disse sporozoittene migrerer til myggens spyttkjertler og injiseres som en mygg tar et blodmåltid. 
For narkotikaoppdagelsesformål ble mygg kunstig infisert med gametocyttinfisert blod i standard membranfôringsanalyse (SMFA). For å påvise infeksjon i myggen og/eller for å vurdere effekten av antimalariaforbindelser, ble midttarmen til hunnmyggen fjernet etter infeksjon og farget med kvikksølvokrom. Denne metoden ble brukt til å forbedre den visuelle deteksjonen av oocyster under mikroskopet for nøyaktig bestemmelse av oocystutbredelse og intensitet.

Totalt antall kontrollerte prøver dissekert var 47, med en gjennomsnittlig til 89 % prevalens og en intensitet på 9,5 oocyster per midttarm (tabell 1, som publisert tidligere22). For MMV1581558 nådde prøvestørrelsen totalt 42 prøver, med en prevalens på 36 % oocyst og en gjennomsnittlig intensitet på 1,5 oocytter. Dette viser en reduksjon i oocystprevalens på 58 % og en TRA på 82 % på tvers av alle tre biologiske replikasjoner (tabell 1).
<p class="...

Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Standard membranfôringsanalyse (SMFA) regnes som gullstandarden for vurdering og identifisering av potensielle antimalariaforbindelser. Dette kunstige fôringssystemet brukes til å infisere mygg for ytterligere å evaluere effekten av slike forbindelser på intensiteten og utbredelsen av Plasmodium falciparum-parasitten .

Standard membranfôringsanalyse for påvisning av Plasmodium falciparum-infeksjon i Anopheles myggvektorer

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Protokollen lar oss oppdage effekten av behandling på malariafølsomheten til afrikanske malariavektorer. For eksempel forbindelser som er rettet mot å blokkere overføring fra mennesket til mygget. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å evaluere et stort antall forbindelser under laboratorieforhold, selv før toksisitetsporter er tilgjengelige.Midgut disseksjoner kan være utfordrende i begynnelsen, men det tar bare litt øvelse. Også for å kunne identifisere oocytter er det ikke alltid lett. Først, ved hjelp av en munnaspirator, plasser 25 ufødte kvinnelige Anopheles gambiae mygg i en 350 milliliter fôringskopp.Merk koppene tydelig for å skille mellom kontroll- og behandlingsgrupper. Velg antall kopper per behandling i henhold til antall tekniske kopier inkludert. Koble glassmatersystemet til et vannbad og hold temperaturen på 37 grader Celsius.Forbered deretter kutarmen eller syntetisk membran ved å skylle den i vann fra springen og kutte den i stykker som er montert for hver mater. Dekk den nederste delen av hver mater og fest membranen med et elastisk bånd. For å bruke fôringskoppene som infeksjonskopper, hold først membranen på toppen av garnene på koppene.Legg deretter infeksjonskoppene under matere. Legg nå til en milliliter gametocyttinfisert blod til matere av kontrollkoppene, og gametocyttinfisert blod med en testforbindelse til matere av behandlingskoppene. La deretter myggene mate i ca 40 minutter.Etter fôring, fjern matere fra koppene, skyll matere og behandle overflødig blod med hypokloritt. Deretter slår du alle myggene ned på isen i ett til to minutter, og velger myggene som har tatt et blodmåltid ved å se etter hovne og røde underliv. Bytt ut sukkervannet som gis annenhver dag til hver infeksjonskopp med en 10% sukkervannpute, og inkuber infeksjonskoppene i et biosikkerhetskammer i åtte til 10 dager.Åtte til 10 dager etter fôring, slå de infiserte myggene ned ved å plassere dem på is. Deretter overfører du dem til merkede rør med 70% etanol, og holder kontroll i hver behandlingsgruppe i separate rør. Hold kontroll- og testgruppene atskilt, overfør myggene til merkede petriskåler foret med filterpapir.Legg til en dråpe PBS på et passende merket glassglass, og overfør en mygg fra filterpapiret til dråpen. Fest myggens thorax med dissekeringsnål. Fjern deretter midttarmen ved å trekke det syvende buksegmentet med tang, og overfør det til en dråpe på 0,1% merkurokrom på et nytt mikroskopglass.La tarmen flekke i åtte til 10 minutter. Legg deretter en dekselslipp på den flekkete tarmen, og se den under lys feltbelysning ved 20 til 40 ganger forstørrelse. Registrer antall oocytter per midgut for kontrollen og hver behandlingsgruppe.I denne studien ble forbindelsen MMV1581558 funnet å signifikant begrense antall Plasmodium falciparum oocyster i midttarmen av kvinnelige Anopheles gambiae mygg i forhold til kontrollen. I kontrollgruppen var gjennomsnittlig prevalens av oocyster i midttarmen 89 % med en gjennomsnittlig intensitet på 9,5 oocyster per midttarm. Men i MMV1581558-behandlede gruppen var gjennomsnittlig oocystsprevalens 36% med en gjennomsnittlig intensitet på bare 1,5 oocyster per midgut.Dermed resulterte MMV1581558-behandling i 58% overføringsblokkerende aktivitet og 82% overføringsreduserende aktivitet i alle tre biologiske replikasjoner. Det er viktig å sikre at mygg spiser på en sunn gametocytkultur. Hvis disse er umodne gametocytter, eller ikke stadium fem gametocytter, er sannsynligheten for å få infeksjon i myggen begrenset eller umulig.Analysen bruker en visuell morfologisk identifikasjonsmetode, men molekylære kvantifiseringsanalyser kan brukes. Dette er imidlertid dyrere og kan begrense bruken av dem i ressursbegrensede laboratorier. Å ha evnen til å gjøre denne teknikken åpner nye veier for å evaluere endringen av malariautbredelse og intensitet mellom nesten alt i mygg.For eksempel sammenligning av arter vektoriell kapasitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Valg av Plasmodium falciparum Parasitter for Cytoadhesion til Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

En enkel protokoll for blodplater-mediert klumping av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infiserte Erytrocytter i en ressurs Dårlig innstilling

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rensing av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites For bruk i Opsonizing Antistoff Analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder for å undersøke om forskrifter rolle Små RNA og Ribosomalt Kapasitet av<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Måling naturlig ervervet phagocytosis-induserende antistoffer mot Plasmodium falciparum parasitter ved en Flow Cytometry-basert analyse

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In vitro Analyse av plasmodiuminfiserte røde blodlegemer som dreies av cytotoksiske lymfocytter

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...