Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
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Os autores gostariam de reconhecer Prof. Lyn-Mari Birkholtz e a Dra. A cepa de parasita foi obtida a partir deste último departamento (não faz parte desta publicação). O Departamento de Ciência e Inovação (DSI) e a Fundação Nacional de Pesquisa (NRF); Iniciativa sul-africana de cadeiras de pesquisa (UID 64763 para LK e UID 84627 para LMB); as Comunidades de Prática nrf (UID 110666 para LMB e LK); e o Conselho De Pesquisa Médica da África do Sul Parcerias Estratégicas de Inovação em Saúde (SHIP) também são reconhecidos por fundos do DSI.

Consulte a Figura 1 para obter uma ilustração do protocolo. A liberação ética foi obtida do Comitê de Ética em Ciências da Saúde da Universidade de Pretória (506/2018) para a retirada e uso de sangue humano.
1. Cultura gametócica
NOTA: Antes da criação da SMFA, foi preparada uma cultura gametocito na Universidade de Pretória (ver Leitor et al.22 para o protocolo completo).
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Para que este protocolo seja executado com sucesso, deve-se dar atenção a cada passo, embora possa ser um processo tedioso e trabalhoso. Um dos passos mais importantes é garantir que a cultura gametócito seja de boa qualidade e que ela consista em gametocitos maduros, com a razão masculina/feminina correta, antes de iniciar a SMFA23,24. Durante a SMFA, também é crucial manter a cultura gametocito na temperatura correta para evitar que os gametas machos exf...

A malária, conhecida como uma das doenças mais destrutivas do mundo, ainda representa uma grande ameaça para vários países - especialmente aqueles dentro da região africana - e contribui para aproximadamente 95% dos casos em todo o mundo1. Esta doença é causada por um parasita protozoário e, juntamente com seu vetor de mosquito Anopheles, esses culpados podem causar grandes danos ao hospedeiro humano2. Mais especificamente, a espécie falciparum do gênero parasita Plasmodium é responsável por cerca de 99% dos casos de malária na África Subsaariana1. Além disso, vários dos principais vetores de mosquito Anopheles (incluindo An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n., e An. funestus Giles) poderiam ser culpados por mais de 95% da transmissão de parasitas globalmente 3,4,5,6,7,8 . Para que o companheirismo parasita-vetor ideal seja estabelecido, o vetor do mosquito deve ser suscetível ao parasita e ser capaz de transmiti-lo9. Além disso, tanto o vetor quanto o parasita devem superar barreiras físicas para formar a combinação infecciosa perfeita - o vetor do mosquito deve ser capaz de sustentar o desenvolvimento de parasitas, e o parasita deve ter a capacidade de superar os mecanismos de defesa do hospedeiro10,11.
Os gametócitos, a fase sexual do parasita P. falciparum, desempenham um papel crucial na conexão dos parceiros vetoriais e parasitas12. O desenvolvimento sexual ocorre in vivo, e gametocitogênese descreve o processo de diferenciação de gametócitos maduros em microgametas masculinos motile e macrogametas femininos13. Outro processo que ocorre dentro do mosquito é a exflagellação - o processo durante o qual o gametocito masculino se transforma em gametas e emerge dos glóbulos vermelhos tomados durante uma refeição sanguínea11. O processo de exflagellação é ainda sugerido para ser aprimorado por uma mudança favorável no ambiente do mosquito midgut14. Após a exflagellação, um zigoto é formado pela fusão dos gametas masculino e feminino13. Do zigoto, surge um ookinete motile e se move da refeição sanguínea para o epitélio do mosquito midgut13. Aqui, o ookinete amadurece, e um oocisto é formado, que, por sua vez, produz esporozoites motile13,15. Os esporozoitas então migram para as glândulas salivares do mosquito e, como o mosquito toma uma refeição sanguínea de seu hospedeiro, esses esporozoitas são injetados na corrente sanguínea do hospedeiro15.
As intervenções de controle da malária, combinando estratégias de controle vetorial e o uso de medicamentos antimaláricos eficazes, tornaram-se cruciais no combate a esta doença15. Com o aumento da resistência a parasitas e mosquitos, a urgência para a identificação de novos compostos antimaláricos está aumentandoem 16. Portanto, a avaliação in vivo dos compostos de bloqueio de transmissão é importante16. Após o desenvolvimento de medicamentos de bloqueio de transmissão tão eficazes, a SMFA tem sido utilizada para avaliar se esses compostos inibem o desenvolvimento sexual de P. falciparum no mosquito Anopheles 17,18,19. Este ensaio ganhou reconhecimento desde a década de 1970-1980 como o padrão-ouro para avaliar o bloqueio de transmissão 20,21. Este ensaio fornece uma alternativa mais barata do que outros ensaios, como o RT-qPCR, que requer equipamentos especializados. Além disso, não são necessários pacientes para executar os experimentos. Este ensaio também envolve o fornecimento de sangue induzido por gametocito para mosquitos fêmeas, que são então dissecados para avaliar se o desenvolvimento oocisto está presente21. Isso permite quantificação de gametocito e detecção de oocistos deformados por causa dos compostos22. Para que um composto seja classificado como eficaz, a prevalência (a proporção de mosquitos que abrigam pelo menos um oocisto no midgut) e o número de oocistos (intensidade) no mosquito midgut devem ser avaliadas para avaliar a inibição da infecção 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

A malária continua sendo uma das doenças mais devastadoras do mundo e, até o momento, a região africana ainda é responsável por 94% de todos os casos em todo o mundo. Esta doença parasitária requer um parasita protozoário, um vetor de mosquito Anopheles e um hospedeiro de vertebrados. O gênero Anopheles compreende mais de 500 espécies, das quais 60 são conhecidas como vetores do parasita. O gênero parasita Plasmodium é composto por 250 espécies, e 48 delas estão envolvidas na transmissão da doença. Além disso, o parasita Plasmodium falciparum contribuiu para cerca de 99,7% dos casos de malária na África Subsaariana nos últimos anos. 
Os gametócitos fazem parte do estágio sexual do parasita e são ingeridos pelo mosquito fêmea ao se alimentarem de um hospedeiro humano infectado. O desenvolvimento do parasita dentro do mosquito é potencializado por condições ambientais favoráveis no meio do mosquito. Aqui, a fusão dos gametas femininos e masculinos ocorre, e os ookinetes motile se originam. Os ookinetes entram no epitélio médio do mosquito, e ookinetas maduros formam oócitos, que, por sua vez, produzem esporozoites motile. Esses esporozoitas migram para as glândulas salivares do mosquito e são injetados enquanto um mosquito toma uma refeição de sangue. 
Para fins de descoberta de drogas, os mosquitos foram artificialmente infectados com sangue infectado por gametocito no ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA). Para detectar infecção dentro do mosquito e/ou avaliar a eficácia dos compostos antimaláricos, os meios-médios dos mosquitos fêmeas foram removidos após a infecção e foram manchados com mercurocromo. Este método foi utilizado para melhorar a detecção visual de oocistos sob o microscópio para a determinação precisa da prevalência e intensidade do oócito.

O número total de amostras de controle dissecadas foi de 47, com prevalência média de 89% e intensidade de 9,5 oocistos por midgut (Tabela 1, conforme publicado anteriormente22). Para o composto MMV1581558, o tamanho da amostra atingiu um total de 42 espécimes, com prevalência de oocisto de 36% e intensidade média de 1,5 oocistos. Isso mostra uma redução na prevalência de oócito de 58% e uma TRA de 82% nas três réplicas biológicas (Tabela 1).
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Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

O ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA) é considerado como o padrão-ouro para a avaliação e identificação de potenciais compostos antimaláricos. Este sistema de alimentação artificial é usado para infectar mosquitos para avaliar ainda mais os efeitos desses compostos na intensidade e prevalência do parasita Plasmodium falciparum .

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

O protocolo permite detectar o efeito do tratamento sobre a suscetibilidade da malária dos vetores africanos da malária. Por exemplo, compostos destinados a bloquear a transmissão do humano para o mosquito. Essa técnica permite que os pesquisadores avaliem um grande número de compostos em condições laboratoriais, mesmo antes da toxicidade que as GATEs estão disponíveis.Dissecções midgut podem ser desafiadoras no início, mas é preciso apenas alguma prática. Além disso, ser capaz de identificar oocistos nem sempre é fácil. Primeiro, usando um aspirador bucal, coloque 25 mosquitos anofelinos de gâmbia fêmeas não alimentados em um copo de alimentação de 350 mililitros.Rotule os copos claramente para distinguir entre grupos de controle e tratamento. Escolha o número de copos por tratamento de acordo com o número de réplicas técnicas incluídas. Conecte o sistema alimentador de vidro a um banho de água e mantenha a temperatura a 37 graus Celsius.Em seguida, prepare o intestino da vaca ou a membrana sintética enxaguando-o na água da torneira e cortando-o em pedaços que são montados para cada alimentador. Cubra a parte inferior de cada alimentador e aperte a membrana com uma faixa elástica. Para usar os copos de alimentação como xícaras de infecção, primeiro, mantenha a membrana em cima das redes dos copos.Em seguida, coloque os copos de infecção debaixo dos alimentadores. Agora, adicione um mililitro de sangue infectado por gametocito aos alimentadores dos copos de controle, e sangue infectado por gametocito com um composto de teste aos alimentadores dos copos de tratamento. Em seguida, deixe os mosquitos se alimentarem por cerca de 40 minutos.Após a alimentação, remova os alimentadores dos copos, enxágue os alimentadores e trate o excesso de sangue com hipoclorito. Em seguida, derrube todos os mosquitos no gelo por um a dois minutos, e selecione os mosquitos que fizeram uma refeição de sangue procurando abdômen inchado e vermelho. Substitua a água de açúcar que é dada em dias alternados para cada xícara de infecção por uma almofada de água 10% açucarada, e incubar os copos de infecção em uma câmara de biossegurança por oito a dez dias.Oito a dez dias após a alimentação, derrube os mosquitos infectados colocando-os no gelo. Em seguida, transfira-os para tubos rotulados com 70% de etanol, mantendo o controle em cada grupo de tratamento em tubos separados. Mantendo os grupos de controle e teste separados, transfira os mosquitos para placas de Petri rotuladas forradas com papel filtro.Adicione uma gota de PBS em um slide de vidro apropriadamente marcado e transfira um mosquito do papel filtro para a gota. Fixar o tórax do mosquito com agulha dissecando. Em seguida, remova o midgut puxando o sétimo segmento abdominal com fórceps, e transfira-o para uma gota de 0,1% mercurocromo em um novo slide de microscópio.Deixe o intestino manchar por 8 a 10 minutos. Em seguida, coloque um deslizamento de cobertura no intestino manchado, e veja-o sob iluminação de campo brilhante em 20 a 40 vezes a ampliação. Registos oocistos por midgut para o controle e cada grupo de tratamento.Neste estudo, o composto MMV1581558 restringiu significativamente o número de oocistos plasmodium falciparum no meio do mosquito Anopheles gambiae feminino em comparação com o controle. No grupo controle, a prevalência média de oocistos no midgut foi de 89% com intensidade média de 9,5 oocistos por midgut. Mas no grupo tratado MMV1581558, a prevalência média de oocistos foi de 36%, com intensidade média de apenas 1,5 oocistos por midgut.Assim, o tratamento MMV1581558 resultou em 58% de atividade de bloqueio de transmissão e redução de 82% da atividade em todas as três réplicas biológicas. É fundamental garantir que os mosquitos se alimentem de uma cultura de gametocite saudável. Se estes são gametocitos imaturos, ou não gametocitos estágio cinco, a probabilidade de obter uma infecção no mosquito é limitada ou impossível.O ensaio utiliza um método de identificação morfológica visual, no entanto, ensaios de quantificação molecular podem ser usados. Isso é, no entanto, mais caro e pode limitar seu uso em laboratórios com recursos restritos. Ter a capacidade de fazer essa técnica abre novos caminhos para avaliar a mudança da prevalência e intensidade da malária entre quase tudo no mosquito.Por exemplo, comparando a capacidade vetorial das espécies.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

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Imunologia e Infecção

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

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Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

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The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

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Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

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In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

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In vitro Ensaio de Morte de Hemácias Infectadas por Plasmodium por Linfócitos Citotóxicos

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...