Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Авторы хотели бы отметитьProf. Лин-Мари Биркхольц и доктор Джанетт Ридер из Департамента биохимии, генетики и микробиологии Института устойчивой борьбы с малярией в Университете Претории за культивирование и снабжение культурой гаметоцитов. Штамм паразита был получен из последнего отдела (не входит в эту публикацию). Департамент науки и инноваций (DSI) и Национальный исследовательский фонд (NRF); Инициатива южноафриканских научно-исследовательских кафедр (UID 64763 для LK и UID 84627 для LMB); сообщества практиков НРФ (UID 110666 LMB и LK); и Южноафриканский совет по медицинским исследованиям Стратегические инновационные партнерства в области здравоохранения (SHIP) также признаны за средства от DSI.

Иллюстрация протокола приведена на рисунке 1 . Этическое разрешение было получено от Комитета по этике медицинских наук Университета Претории (506/2018) на изъятие и использование человеческой крови.
1. Культура гаметоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ:...

Чтобы этот протокол был успешно выполнен, следует уделять внимание каждому шагу, даже если это может быть утомительным и трудоемким процессом. Одним из наиболее важных шагов является обеспечение того, чтобы культура гаметоцитов была хорошего качества и чтобы она состояла из зрелых гам...

Малярия, известная как одна из самых разрушительных болезней во всем мире, по-прежнему представляет большую угрозу для ряда стран, особенно для стран Африканского региона, и составляет примерно 95% случаев заболевания во всеммире1. Это заболевание вызывается простейшим паразитом и вместе со своим комаром-переносчиком Anopheles эти виновники могут нанести большой вред человеку-хозяину2. В частности, вид falciparum рода паразитов Plasmodium является причиной примерно 99% случаев малярии в странах Африки к югу от Сахары1. В дополнение к этому, несколько основных переносчиков комаров Anopheles (включая An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. и An. funestus Giles) могут быть обвинены в более чем 95% передачи паразитов во всем мире 3,4,5,6,7,8 . Для установления идеального общения паразита-переносчика комар-переносчик должен быть восприимчив к паразиту и быть в состоянии передать его9. Кроме того, как переносчик, так и паразит должны преодолевать физические барьеры, чтобы сформировать идеальную инфекционную комбинацию - комар-переносчик должен быть в состоянии поддерживать развитие паразита, а паразит должен иметь способность преодолевать защитные механизмы хозяина10,11.
Гаметоциты, половая стадия паразита P. falciparum, играют решающую роль в соединении вектора и паразита партнеров12. Половое развитие происходит in vivo, а гаметоцитогенез описывает процесс дифференцировки зрелых гаметоцитов в подвижные мужские микрогаметы и женские макрогаметы13. Другим процессом, который происходит внутри комара, является эксфлагелляция - процесс, во время которого мужской гаметоцит превращается в гаметы и выходит из красных кровяных клеток, захваченных во время кровяной пищи11. Далее предполагается, что процесс эксфлагелляции усиливается благоприятным изменением окружающей среды комара-midgut14. После эксфлагелляции зигота образуется путем слияния мужской и женской гамет13. Из зиготы возникает подвижная окинета и перемещается из кровяной муки в эпителий комара-мидгута13. Здесь созревает окинет, и образуется ооциста, которая, в свою очередь, вырабатывает подвижных спорозоитов13,15. Спорозоиты затем мигрируют в слюнные железы комаров, и, когда комар принимает кровяную муку от своего хозяина, эти спорозоиты вводятся в кровоток хозяина15.
Мероприятия по борьбе с малярией, сочетающие стратегии борьбы с переносчиками инфекции и использование эффективных противомалярийных препаратов, приобрели решающее значение в борьбе с этимзаболеванием15. С ростом устойчивости к паразитам и комарам срочность выявления новых противомалярийных соединений возрастаетна 16. Поэтому важна оценка in vivo соединений, блокирующих передачу16. После разработки таких эффективных препаратов, блокирующих передачу, SMFA был использован для оценки того, ингибируют ли эти соединения половое развитие P. falciparum у комара Anopheles 17,18,19. Этот анализ получил признание с 1970-1980-х годов в качестве золотого стандарта для оценки блокировки передачи20,21. Этот анализ обеспечивает более дешевую альтернативу, чем другие анализы, такие как RT-qPCR, который требует специализированного оборудования. Кроме того, для проведения экспериментов не требуется никаких пациентов. Этот анализ также включает в себя предоставление крови, индуцированной гаметоцитами, самкам комаров, которые затем рассекаются, чтобы оценить, присутствует ли развитие ооцисты21. Это позволяет количественно определять гаметоциты и обнаруживать деформированные ооцисты из-за соединений22. Чтобы соединение было классифицировано как эффективное, распространенность (доля комаров, которые содержат по крайней мере одну ооцисту в средней кишке) и количество ооцист (интенсивность) у комара-акушерки должны быть оценены для оценки ингибирования инфекции 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

Малярия остается одним из самых разрушительных заболеваний во всем мире, и на сегодняшний день африканский регион по-прежнему является причиной 94% всех случаев заболевания во всем мире. Это паразитарное заболевание требует простейшего паразита, комара-переносчика Anopheles и хозяина позвоночных. Род Anopheles включает более 500 видов, из которых 60 известны как переносчики паразита. Род паразитов Plasmodium состоит из 250 видов, и 48 из них участвуют в передаче болезни. Кроме того, паразит Plasmodium falciparum внес свой вклад в 99,7% случаев малярии в странах Африки к югу от Сахары в последние годы. 
Гаметоциты являются частью половой стадии паразита и поглощаются самкой комара при питании инфицированным человеческим хозяином. Дальнейшее развитие паразита внутри комара усиливается благоприятными условиями окружающей среды в средней кишке комара. Здесь происходит слияние женских и мужских гамет, и возникают подвижные окинеты. Окинеты попадают в эпителий средней кишки комара, а зрелые окинеты образуют ооцисты, которые, в свою очередь, продуцируют подвижные спорозоиты. Эти спорозоиты мигрируют в слюнные железы комара и вводятся, когда комар принимает кровяную муку. 
Для целей открытия лекарств комары были искусственно инфицированы гаметоцитарной кровью в стандартном анализе мембранного питания (SMFA). Для выявления инфекции у комара и/или для оценки эффективности противомалярийных соединений средние полоски самок комаров удаляли после заражения и окрашивали ртурохромом. Этот метод был использован для улучшения визуального обнаружения ооцист под микроскопом для точного определения распространенности и интенсивности ооцист.

Общее число рассеченных контрольных образцов составило 47, со средней распространенностью до 89% и интенсивностью 9,5 ооцист на среднюю кутку (таблица 1, опубликованная ранее22). Для соединения MMV1581558 размер выборки достиг в общей сложности 42 образцов с распространенно...

Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Стандартный анализ мембранной подачи (SMFA) считается золотым стандартом для оценки и идентификации потенциальных противомалярийных соединений. Эта система искусственного кормления используется для заражения комаров для дальнейшей оценки воздействия таких соединений на интенсивность и распространенность паразита Plasmodium falciparum .

Стандартный анализ мембранного питания для выявления инфекции Plasmodium falciparum у комаров-переносчиков Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Протокол позволяет выявить влияние лечения на восприимчивость к малярии африканских переносчиков малярии. Например, соединения, направленные на блокирование передачи от человека к комару. Этот метод позволяет исследователям оценивать большое количество соединений в лабораторных условиях, даже до того, как будут доступны токсичные GATE.Рассечение средней кишки может быть сложным поначалу, но это просто требует некоторой практики. Кроме того, уметь идентифицировать ооцисты не всегда легко. Во-первых, используя ротовой аспиратор, поместите 25 некормленных самок комаров Anopheles gambiae в чашку для кормления объемом 350 миллилитров.Четко обозначьте чашки, чтобы различать контрольные и лечебные группы. Выберите количество чашек на процедуру в соответствии с количеством включенных технических реплик. Подключите систему подачи стекла к водяной бане и поддерживайте температуру на уровне 37 градусов цельсия.Затем подготовьте кишечник коровы или синтетическую мембрану, промыв ее в водопроводной воде и разрезав на кусочки, которые подходят для каждой кормушки. Накройте нижнюю часть каждого питателя и скрепите мембрану эластичной лентой. Для использования чашек для кормления в качестве чашек для инфекции, во-первых, держите мембрану поверх сеток чашек.Затем поместите чашки для инфекции под кормушки. Теперь добавьте один миллилитр крови, инфицированной гаметоцитами, в кормушки контрольных чашек, а зараженную гаметоцитами кровь с тестовым соединением в кормушки лечебных чашек. Затем оставьте комаров кормиться примерно на 40 минут.После кормления выньте кормушки из чашек, промойте кормушки, обработайте лишнюю кровь гипохлоритом. Затем сбивайте всех комаров на лед в течение одной-двух минут и выбирайте комаров, которые принимали кровавую пищу, ища опухшие и красные брюшки. Замените сахарную воду, которая дается в разные дни в каждую чашку инфекции, на 10% сахарную водную прокладку и инкубируйте чашки инфекции в камере биобезопасности в течение восьми-10 дней.Через восемь-10 дней после кормления сбивайте зараженных комаров, помещая их на лед. Затем перенесите их в меченые пробирки с 70% этанолом, сохраняя контроль в каждой группе обработки в отдельных пробирках. Разделяя контрольную и тестовую группы, перенесите комаров на маркированные чашки Петри, выстланные фильтровальной бумагой.Добавьте каплю PBS на стеклянный слайд с соответствующей маркировкой и перенесите комара из фильтровальной бумаги в каплю. Закрепите грудную клетку комара рассекающей иглой. Затем удалите среднюю кишку, потянув седьмой брюшной сегмент щипцами, и перенесите ее в каплю 0,1% ртурохрома на новом слайде микроскопа.Оставьте кишечник окрашиваться в течение восьми-10 минут. Затем поместите крышку на окрашенную кишку и просмотрите ее при ярком освещении поля с увеличением в 20-40 раз. Запишите количество ооцист на среднюю кишку для контрольной группы и каждой группы лечения.В этом исследовании было обнаружено, что соединение MMV1581558 значительно ограничивает количество ооцист Plasmodium falciparum в средней кишке самок комаров Anopheles gambiae по сравнению с контролем. В контрольной группе средняя распространенность ооцист в средней кишке составила 89% при средней интенсивности 9,5 ооцист на среднюю кишку. Но в группе, получавшей лечение MMV1581558, средняя распространенность ооцист составила 36% со средней интенсивностью всего 1,5 ооцисты на среднюю кишку.Таким образом, лечение MMV1581558 привело к 58% активности блокировки передачи и 82% активности снижения передачи во всех трех биологических репликатах. Крайне важно обеспечить, чтобы комары питались здоровой культурой гаметоцитов. Если это незрелые гаметоциты, или не гаметоциты пятой стадии, вероятность заражения комаром ограничена или невозможна.Анализ использует метод визуальной морфологической идентификации, однако могут быть использованы молекулярные количественные анализы. Это, однако, дороже и может ограничить их использование в лабораториях с ограниченными ресурсами. Возможность использовать эту технику открывает новые возможности для оценки изменения распространенности и интенсивности малярии практически между всеми комарами.Например, сравнение векторной способности вида.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Альфавирус трансдуцирующих Система: Инструмент для визуализации инфекции у комаров-переносчиков

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Усиление и Количественная РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-инфицированных с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения стандартными клиническими Анализы

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; В пробирке</em&gt; Ко-инфекция моделью для изучения<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Простой протокол для опосредованного тромбоцитами слипания<em&gt; Малярийного плазмодия</em&gt;-Инфицированных эритроцитов в условиях ограниченных ресурсов Настройка

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Разделение<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; Поздняя стадия-инфицированных эритроцитов магнитных средств

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Высокая доходность Очистка<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; Мерозоиты для использования в Opsonizing антитела анализы

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Методы по расследованию регулирующей роли малых РНК и рибосомного размещения в<em&gt; Малярийного плазмодия</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Измерение естественно приобретенных фагоцитоз-индуцирующих антител к паразитам Plasmodium falciparum с помощью анализа на основе цитометрии потока

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

В пробирке Анализ уничтожения эритроцитов, инфицированных плазмодием, цитотоксическими лимфоцитами

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...