Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Författarna vill tacka Prof. Lyn-Mari Birkholtz och Dr. Janette Reader från Institutionen för biokemi, genetik och mikrobiologi, Institute for Sustainable Malaria Control, vid University of Pretoria, för odling och leverans av gametocytkulturen. Parasitstammen erhölls från den senare avdelningen (ingår inte i denna publikation). Institutionen för vetenskap och innovation (DSI) och National Research Foundation (NRF); South African Research Chairs Initiative (UID 64763 till LK och UID 84627 till LMB); NRF Communities of Practice (UID-110666 till LMB och LK); och South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) erkänns också för medel från DSI.

Se figur 1 för en illustration av protokollet. Etiskt godkännande erhölls från University of Pretoria Health Sciences Ethics Committee (506/2018) för uttag och användning av humant blod.
1. Gametocytkultur
OBS: Innan SMFA inrättades förbereddes en gametocytkultur vid University of Pretoria (se Reader et al.22 för hela protokollet).
<ol><li>Förbered en gametocytkultur som består av st...

För att detta protokoll ska kunna utföras framgångsrikt bör uppmärksamhet ägnas åt varje steg, även om det kan vara en tråkig och mödosam process. Ett av de viktigaste stegen är att se till att gametocytkulturen är av god kvalitet och att den består av mogna gametocyter, med rätt förhållande mellan man och kvinna, innan SMFA23,24 startas. Under SMFA är det också viktigt att hålla gametocytkulturen vid rätt temperatur för att förhindra att ma...

Malaria, känd som en av de mest destruktiva sjukdomarna i världen, utgör fortfarande ett stort hot mot flera länder - särskilt de inom den afrikanska regionen - och bidrar till cirka 95% av fallen över hela världen1. Denna sjukdom orsakas av en protozoparasit och tillsammans med dess Anopheles myggvektor kan dessa synder orsaka stor skada på den mänskliga värden2. Mer specifikt är falciparum-arten av parasitsläktet Plasmodium ansvarig för uppskattningsvis 99% av malariafallen i Afrika söder om Sahara1. Utöver detta kan flera stora Anopheles myggvektorer (inklusive An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. och An. funestus Giles) klandras för mer än 95% av parasitöverföringen globalt 3,4,5,6,7,8 . För att det ideala parasitvektorsällskapet ska kunna fastställas bör myggvektorn vara mottaglig för parasiten och kunna överföra den9. Dessutom bör både vektorn och parasiten övervinna fysiska hinder för att bilda den perfekta infektionskombinationen - myggvektorn bör kunna upprätthålla parasitutveckling, och parasiten bör ha förmågan att övervinna värdens försvarsmekanismer10,11.
Gametocyter, det sexuella stadiet av parasiten P. falciparum, spelar en avgörande roll för att ansluta vektorn och parasitpartnerna12. Sexuell utveckling sker in vivo, och gametocytogenes beskriver processen för differentiering av mogna gametocyter till rörliga manliga mikrogameter och kvinnliga makrogametter13. En annan process som äger rum inom myggan är exflagellation - processen under vilken den manliga gametocyten förvandlas till könsceller och kommer ut ur de röda blodkropparna som tas upp under en blodmåltid11. Exflagellationsprocessen föreslås vidare förbättras genom en gynnsam förändring av miljön i mygganmidgut 14. Efter exflagellation bildas en zygot genom fusion av manliga och kvinnliga gameter13. Från zygoten uppstår en rörlig ookinet och rör sig från blodmjölet till epitelet i myggans midgut13. Här mognar ookinaten och en oocyst bildas, som i sin tur producerar rörliga sporozoiter13,15. Sporozoiterna migrerar sedan till myggens spottkörtlar och när myggan tar en blodmjöl från sin värd injiceras dessa sporozoiter i värdens blodomlopp15.
Malariakontrollinsatser, som kombinerar vektorkontrollstrategier och användning av effektiva läkemedel mot malaria, har blivit avgörande för att bekämpa denna sjukdom15. Med en ökning av parasit- och myggresistens ökar brådskan för identifiering av nya malariaföreningar16. Därför är in vivo-utvärderingen av transmissionsblockerande föreningar viktig16. Efter utvecklingen av sådana effektiva överföringsblockerande läkemedel har SMFA använts för att bedöma om dessa föreningar hämmar den sexuella utvecklingen av P. falciparum i Anopheles-myggan 17,18,19. Denna analys har fått erkännande sedan 1970-1980-talet som guldstandarden för utvärdering av överföringsblockering20,21. Denna analys ger ett billigare alternativ än andra analyser som RT-qPCR, vilket kräver specialutrustning. Dessutom behövs inga patienter för att utföra experimenten. Denna analys innefattar också tillhandahållande av gametocytinducerat blod till kvinnliga myggor, som sedan dissekeras för att utvärdera om oocystutveckling är närvarande21. Detta möjliggör gametocytkvantifiering och detektion av deformerade oocyster på grund av föreningarna22. För att en förening ska klassificeras som effektiv måste prevalensen (andelen myggor som har minst en oocyst i midguten) och antalet oocyster (intensitet) i myggans midgut utvärderas för att bedöma infektionshämning 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

Malaria är fortfarande en av de mest förödande sjukdomarna i världen och hittills är den afrikanska regionen fortfarande ansvarig för 94% av alla fall i världen. Denna parasitiska sjukdom kräver en protozo parasit, en Anopheles myggvektor och en ryggradsdjursvärd. Anopheles-släktet omfattar mer än 500 arter, varav 60 är kända som vektorer av parasiten. Plasmodium-parasitsläktet består av 250 arter, och 48 av dessa är involverade i sjukdomsöverföring. Dessutom har parasiten Plasmodium falciparum bidragit till uppskattningsvis 99,7% av malariafallen i Afrika söder om Sahara de senaste åren. 
Gametocyter utgör en del av parasitens sexuella stadium och intas av den kvinnliga myggan vid utfodring på en infekterad mänsklig värd. Ytterligare utveckling av parasiten inom myggan förbättras av gynnsamma miljöförhållanden i myggans midgut. Här sker fusionen av kvinnliga och manliga könsceller, och de rörliga ookineterna härstammar. Ookineterna kommer in i myggans midgutepitel, och mogna ookineter bildar oocyster, som i sin tur producerar rörliga sporozoiter. Dessa sporozoiter migrerar till myggans spottkörtlar och injiceras som en mygga tar en blodmjöl. 
För läkemedelsupptäcktsändamål infekterades myggor artificiellt med gametocytinfekterat blod i standard membranmatningsanalysen (SMFA). För att upptäcka infektion i myggan och/eller för att bedöma effekten av malariaföreningar avlägsnades mygghonornas midguts efter infektion och färgades med merkurokrom. Denna metod användes för att förbättra den visuella detekteringen av oocyster under mikroskopet för noggrann bestämning av oocystprevalens och intensitet.

Det totala antalet dissekerade kontrollprover var 47, med en genomsnittlig prevalens på 89% och en intensitet på 9,5 oocyster per midgut (tabell 1, som publicerats tidigare22). För föreningen MMV1581558 nådde provstorleken totalt 42 prover, med en 36% oocystprevalens och en genomsnittlig intensitet på 1,5 oocyster. Detta visar en minskning av oocystprevalensen med 58% och en TRA på 82% för alla tre biologiska replikat (tabell 1).
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Standardmembranmatningsanalysen (SMFA) betraktas som guldstandarden för bedömning och identifiering av potentiella malariaföreningar. Detta artificiella utfodringssystem används för att infektera myggor för att ytterligare utvärdera effekterna av sådana föreningar på intensiteten och förekomsten av parasiten Plasmodium falciparum .

Standardmembranmatningsanalys för detektion av plasmodium falciparum-infektion i Anopheles myggvektorer

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Protokollet tillåter oss att upptäcka effekten av behandling på malariakänsligheten hos afrikanska malariavektorer. Till exempel föreningar som syftar till att blockera överföring från människan till myggan. Denna teknik gör det möjligt för forskare att utvärdera ett stort antal föreningar under laboratorieförhållanden, även innan toxicitetsgrindar finns tillgängliga.Midgut-dissektioner kan vara utmanande till en början men det krävs bara lite övning. Att kunna identifiera oocyster är inte alltid lätt. Först, med hjälp av en munsugare, placera 25 ofededa kvinnliga Anopheles gambiae-myggor i en 350 ml matningskopp.Märk kopparna tydligt för att skilja mellan kontroll- och behandlingsgrupper. Välj antalet koppar per behandling enligt antalet tekniska replikat som ingår. Anslut glasmatarsystemet till ett vattenbad och håll temperaturen vid 37 grader Celsius.Förbered sedan ko-tarmen eller syntetmembranet genom att skölja det i kranvatten och skära det i bitar som är monterade för varje matare. Täck den nedre delen av varje matare och fäst membranet med ett elastiskt band. För att använda matningskopparna som infektionskoppar, håll först membranet ovanpå kopparnas nät.Placera sedan infektionskopparna under matare. Lägg nu till en milliliter gametocytinfekterat blod till matare av kontrollkopparna och gametocytinfekterat blod med en testförening till matare av behandlingskopparna. Låt sedan myggorna mata i ca 40 minuter.Efter matning, ta bort matare från kopparna, skölj matare och behandla överskott av blod med hypoklorit. Slå sedan ner alla myggor på isen i en till två minuter och välj de myggor som har tagit en blodmåltid genom att leta efter svullna och röda bukar. Byt ut sockervattnet som ges varannan dag till varje infektionskopp med en 10% sockervattenkudde och inkubera infektionskopparna i en biosäkerhetskammare i åtta till 10 dagar.Åtta till 10 dagar efter utfodring, slå ner de infekterade myggorna genom att placera dem på is. Överför dem sedan till märkta rör med 70% etanol och håll kontrollen i varje behandlingsgrupp i separata rör. Håll kontroll- och testgrupperna åtskilda, överför myggorna till märkta petriskålar fodrade med filterpapper.Tillsätt en droppe PBS på en lämpligt märkt glasskiva och överför en mygga från filterpapperet till droppen. Fäst myggans bröstkorg med dissekeringsnål. Ta sedan bort midgut genom att dra det sjunde buksegmentet med pincett och överför det till en droppe på 0,1% mercurokrom på en ny mikroskopbild.Låt tarmen färga av sig i åtta till 10 minuter. Placera sedan en täckglidning på den färgade tarmen och se den under ljus fältbelysning vid 20 till 40 gånger förstoring. Registrera antalet oocyster per midgut för kontrollen och varje behandlingsgrupp.I denna studie befanns föreningen MMV1581558 avsevärt begränsa antalet Plasmodium falciparum oocyster i midgut av kvinnliga Anopheles gambiae-myggor jämfört med kontrollen. I kontrollgruppen var den genomsnittliga prevalensen av oocyster i midgut 89% med en genomsnittlig intensitet på 9,5 oocyster per midgut. Men i den behandlade gruppen med MMV1581558 var den genomsnittliga förekomsten av oocyster 36 % med en genomsnittlig intensitet på endast 1,5 oocyster per midgut.Således resulterade MMV1581558-behandling i 58% överföringsblockeringsaktivitet och 82% överföringsreducerande aktivitet i alla tre biologiska replikat. Det är viktigt att se till att myggor livnär sig på en hälsosam gametocytkultur. Om dessa är omogna gametocyter, eller inte steg fem gametocyter, är sannolikheten för att få en infektion i myggan begränsad eller omöjlig.Analysen använder en visuell morfologisk identifieringsmetod, men molekylära kvantifieringsanalyser kan användas. Detta är dock dyrare och kan begränsa deras användning i resursbegränsade laboratorier. Att ha förmågan att göra denna teknik öppnar nya vägar för att utvärdera förändringen av malariaprevalens och intensitet mellan nästan vad som helst i mygga.Till exempel att jämföra arters vektorkapacitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alfaviruset Transducing System: Verktyg för att visualisera Infektion i Mosquito Vektorer

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Förstärka och kvantifiera HIV-1 RNA i hiv-infekterade individer med virusnivåer under gränsen för upptäckt med vanliga kliniska analyser

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Val av Plasmodium falciparum Parasiter för Cytoadhesion till Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Ett enkelt protokoll för trombocyter-medierad klumpande av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infekterade erytrocyter i ett resurssvaga inställning

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Sent skede-infekterade erytrocyter genom magnetiska organ

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rening av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites för användning i opsoniserande Antibody analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder för att undersöka den reglerande roll små RNA och Ribosomalt Beläggning av<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Mätning Naturligt förvärvade Phagocytosis-inducerande antikroppar mot Plasmodium falciparum parasiter av en Flow Cytometry-baserade assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In vitro Analys av plasmodiuminfekterade avdödande röda blodkroppar av cytotoxiska lymfocyter

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...