Name: standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Yazarlar teşekkür ederProf. Pretoria Üniversitesi Biyokimya, Genetik ve Mikrobiyoloji Bölümü'nden Lyn-Mari Birkholtz ve Dr. Janette Reader, gametosit kültürünün kültürlenmesi ve tedarik edilmesi için Pretoria Üniversitesi Sürdürülebilir Sıtma Kontrolü Enstitüsü. Parazit suşu ikinci bölümden elde edildi (bu yayının bir parçası değil). Bilim ve İnovasyon Bölümü (DSI) ve Ulusal Araştırma Vakfı (NMG); Güney Afrika Araştırma Başkanları Girişimi (UID 64763'ten LK'ya ve UID 84627'den LMB'ye); NMG Uygulama Toplulukları (UID 110666 LMB ve LK'ya); ve Güney Afrika Tıbbi Araştırma Konseyi Stratejik Sağlık İnovasyon Ortaklıkları (SHIP) da DSI'dan gelen fonlar için kabul edilmektedir.

Protokolün bir örneği için Şekil 1'e bakın. İnsan kanının geri çekilmesi ve kullanılması için Pretoria Üniversitesi Sağlık Bilimleri Etik Kurulu'ndan (506/2018) etik izin alınmıştır.
1. Gametosit kültürü
NOT: SMFA'yı kurmadan önce, Pretoria Üniversitesi'nde bir gametosit kültürü hazırlanmıştır (protokolün tamamı için Reader ve ark.22'ye bakınız).
<ol><li>NF...

Bu protokolün başarılı bir şekilde yürütülebilmesi için, sıkıcı ve zahmetli bir süreç olsa bile, her adıma dikkat edilmelidir. En önemli adımlardan biri, SMFA23,24'e başlamadan önce gametosit kültürünün kaliteli olmasını ve doğru erkek:kadın oranına sahip olgun gametositlerden oluşmasını sağlamaktır. SMFA sırasında, erkek gametlerin sivrisineğe girmeden önce patlamasını önlemek için gametosit kültürünü doğru sıcaklı...

Dünya çapında en yıkıcı hastalıklardan biri olarak bilinen sıtma, birçok ülkeye, özellikle de Afrika bölgesindekilere hala büyük bir tehdit oluşturmaktadır ve dünya çapındaki vakaların yaklaşık% 95'ine katkıda bulunmaktadır1. Bu hastalığa bir protozoan parazit neden olur ve Anopheles sivrisinek vektörü ile birlikte, bu suçlular insan konakçısına büyük zarar verebilir2. Daha spesifik olarak, Plasmodium parazit cinsinin falciparum türleri, Sahra altı Afrika'daki sıtma vakalarının tahmini% 99'undan sorumludur1. Buna ek olarak, birkaç büyük Anopheles sivrisinek vektörü (An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. ve An. funestus Giles dahil) küresel olarak parazit iletiminin% 95'inden fazlası için suçlanabilir 3,4,5,6,7,8 . İdeal parazit-vektör arkadaşlığının kurulması için, sivrisinek vektörünün parazite duyarlı olması veonu 9 iletebilmeli olmalıdır. Ayrıca, hem vektör hem de parazit, mükemmel enfektif kombinasyonu oluşturmak için fiziksel engellerin üstesinden gelmelidir - sivrisinek vektörü parazit gelişimini sürdürebilmeli ve parazit, konağın savunma mekanizmalarının üstesinden gelme yeteneğine sahip olmalıdır10,11.
P. falciparum parazitinin cinsel aşaması olan gametositler, vektör ve parazit partnerlerinin birbirine bağlanmasında çok önemli bir rol oynar12. Cinsel gelişim in vivo olarak gerçekleşir ve gametositogenez, olgun gametositlerin hareketli erkek mikrogametlere ve dişi makrogametlere farklılaşma sürecini tanımlar13. Sivrisinek içinde gerçekleşen bir başka süreç de kamçılanmadır – erkek gametositin gametlere dönüştüğü ve bir kan yemeği sırasında alınan kırmızı kan hücrelerinden çıktığı süreç11. Eksflagellasyon sürecinin, sivrisinek midgut14'ün ortamındaki olumlu bir değişiklikle arttırılması önerilmektedir. Eksflagellasyondan sonra, erkek ve dişi gametlerin kaynaşmasıyla bir zigot oluşur13. Zigottan, hareketli bir ookinete ortaya çıkar ve kan unundan sivrisinek midgut13'ün epiteline doğru hareket eder. Burada, ookinete olgunlaşır ve sırayla hareketli sporozoitler13,15 üreten bir ookist oluşur. Sporozoitler daha sonra sivrisinek tükürük bezlerine göç eder ve sivrisinek konakçısından bir kan unu aldığından, bu sporozoitler konağın kan dolaşımına enjekte edilir15.
Vektör kontrol stratejileri ile etkili sıtma önleyici ilaçların kullanımını birleştiren sıtma kontrol müdahaleleri, bu hastalıkla mücadelede çok önemli hale gelmiştir15. Parazit ve sivrisinek direncindeki artışla birlikte, yeni sıtma önleyici bileşiklerin tanımlanması için aciliyetartmaktadır 16. Bu nedenle, iletimi bloke eden bileşiklerin in vivo değerlendirilmesi önemlidir16. Bu tür etkili bulaşmayı engelleyen ilaçların geliştirilmesinden sonra, SMFA, bu bileşiklerin Anopheles sivrisinek17,18,19'daki P. falciparum'un cinsel gelişimini inhibe edip etmediğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu tahlil, 1970-1980'lerden bu yana, iletim blokajı 20,21'i değerlendirmek için altın standart olarak tanınmıştır. Bu tahlil, özel ekipman gerektiren RT-qPCR gibi diğer tahlillerden daha ucuz bir alternatif sunar. Ayrıca, deneyleri yürütmek için hiçbir hastaya gerek yoktur. Bu tahlil aynı zamanda dişi sivrisineklere gametosit kaynaklı kanın sağlanmasını da içerir, bunlar daha sonra ookist gelişiminin mevcut olup olmadığını değerlendirmek için disseke edilir21. Bu, gametosit miktarının belirlenmesine ve bileşikler22 nedeniyle deforme olmuş ookistlerin tespit edilmesine izin verir. Bir bileşiğin etkili olarak sınıflandırılması için, enfeksiyon inhibisyonunu değerlendirmek için prevalansı (midgutta en az bir ookist barındıran sivrisineklerin oranı) ve sivrisinek midgutundaki ookist sayısı (yoğunluk) değerlendirilmelidir 17,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine intestine/</td>
			<td>Butchery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound MMV1581558</td>
			<td>MMV</td>
			<td></td>
			<td>Pandemic response box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles</td>
			<td>WRIM</td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon tube</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass feeders</td>
			<td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism (8.3.0)</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercurochrome</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>129-16-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Merch (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Cleansafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex biosafety cabinet</td>
			<td>Wits University</td>
			<td></td>
			<td>Made by the contractors at Wits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (350 mL)</td>
			<td>Plastic Land</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard membrane feeding assay for the detection of plasmodium falciparum infection in anopheles mosquito vectors

Sıtma, dünya çapında en yıkıcı hastalıklardan biri olmaya devam etmektedir ve bugüne kadar, Afrika bölgesi hala dünya çapındaki tüm vakaların% 94'ünden sorumludur. Bu paraziter hastalık bir protozoan parazit, bir Anopheles sivrisinek vektörü ve bir omurgalı konakçı gerektirir. Anopheles cinsi, 60'ı parazitin vektörleri olarak bilinen 500'den fazla türden oluşur. Plasmodium parazit cinsi 250 türden oluşur ve bunların 48'i hastalık bulaşmasında rol oynar. Ayrıca, Plasmodium falciparum paraziti, son yıllarda Sahra altı Afrika'daki sıtma vakalarının tahmini% 99.7'sine katkıda bulunmuştur. 
Gametositler, parazitin cinsel aşamasının bir parçasını oluşturur ve enfekte bir insan konakçısı üzerinde beslendikten sonra dişi sivrisinek tarafından yutulur. Parazitin sivrisinek içindeki daha da gelişmesi, sivrisineğin orta bağırsağındaki elverişli çevresel koşullarla arttırılır. Burada, dişi ve erkek gametlerin kaynaşması gerçekleşir ve hareketli ookinetler ortaya çıkar. Ookinetes, sivrisineğin midgut epiteline girer ve olgun ookinetes, sırayla hareketli sporozoitler üreten ookistler oluşturur. Bu sporozoitler sivrisineğin tükürük bezlerine göç eder ve bir sivrisinek kan unu alırken enjekte edilir. 
İlaç keşfi amacıyla, sivrisinekler standart membran besleme testinde (SMFA) gametosit ile enfekte olmuş kan ile yapay olarak enfekte edildi. Sivrisinek içindeki enfeksiyonu tespit etmek ve / veya sıtma önleyici bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için, dişi sivrisineklerin orta bağırsakları enfeksiyon sonrası çıkarıldı ve merkürokrom ile boyandı. Bu yöntem, ookist prevalansının ve yoğunluğunun doğru belirlenmesi için mikroskop altında ookistlerin görsel tespitini arttırmak için kullanıldı.

Diseke edilen toplam kontrol örneği sayısı 47 olup, ortalama %89 prevalansı ve midgut başına 9.5 ookist yoğunluğu saptanmıştır (Tablo 1, daha önce yayınlandığı gibi22). MMV1581558 bileşiği için, örneklem büyüklüğü% 36 ookist prevalansı ve ortalama 1.5 ookist yoğunluğu ile toplam 42 örneğe ulaştı. Bu, her üç biyolojik replikantta da ookist prevalansında% 58'lik bir azalma ve% 82'lik bir TRA olduğunu göstermektedir (Tablo 1).</p...

Watch this Scientific Journal Video about Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors at JoVE.com

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Protokol, tedavinin Afrika sıtma vektörlerinin sıtma duyarlılığı üzerindeki etkisini tespit etmemizi sağlar. Örneğin, insandan sivrisineğe bulaşmayı engellemeyi amaçlayan bileşikler. Bu teknik, araştırmacıların toksisite GATE'leri mevcut olmadan önce bile, laboratuvar koşullarında çok sayıda bileşiği değerlendirmelerini sağlar.Midgut diseksiyonları ilk başta zor olabilir, ancak sadece biraz pratik gerektirir. Ayrıca, ookistleri tanımlayabilmek her zaman kolay değildir. İlk olarak, bir ağız aspiratörü kullanarak, 25 adet beslenmemiş dişi Anopheles gambiae sivrisineklerini 350 mililitrelik bir besleme kabına yerleştirin.Kontrol ve tedavi grupları arasında ayrım yapmak için bardakları açıkça etiketleyin. Dahil edilen teknik kopyaların sayısına göre tedavi başına bardak sayısını seçin. Cam besleyici sistemini bir su banyosuna bağlayın ve sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun.Daha sonra, bağırsağını veya sentetik zarı musluk suyunda durulayarak ve her besleyici için takılı olan parçalara ayırarak hazırlayın. Her besleyicinin alt kısmını örtün ve membranı elastik bir bantla sabitleyin. Besleme kaplarını enfeksiyon kapları olarak kullanmak için, önce zarı bardakların ağlarının üstünde tutun.Daha sonra enfeksiyon kaplarını besleyicilerin altına yerleştirin. Şimdi, kontrol kaplarının besleyicilerine bir mililitre gametosit ile enfekte olmuş kan ve tedavi kaplarının besleyicilerine bir test bileşiği ile gametosit ile enfekte olmuş kan ekleyin. Sonra sivrisinekleri yaklaşık 40 dakika beslemeye bırakın.Beslendikten sonra, besleyicileri bardaklardan çıkarın, besleyicileri durulayın ve fazla kanı hipoklorit ile tedavi edin. Ardından, tüm sivrisinekleri bir ila iki dakika boyunca buzun üzerine vurun ve şişmiş ve kırmızı karınları arayarak kan yemeği alan sivrisinekleri seçin. Her enfeksiyon kabına alternatif günlerde verilen şekerli suyu% 10'luk bir şekerli su pedi ile değiştirin ve enfeksiyon bardaklarını sekiz ila 10 gün boyunca bir biyogüvenlik odasında inkübe edin.Beslenmeden sekiz ila 10 gün sonra, enfekte sivrisinekleri buzun üzerine yerleştirerek yıkın. Daha sonra, bunları% 70 etanol içeren etiketli tüplere aktarın ve her tedavi grubunda kontrolü ayrı tüplerde tutun. Kontrol ve test gruplarını ayrı tutarak, sivrisinekleri filtre kağıdı ile kaplı etiketli Petri kaplarına aktarın.Uygun şekilde işaretlenmiş bir cam slayta bir damla PBS ekleyin ve filtre kağıdından damlaya bir sivrisinek aktarın. Sivrisinek göğüs kafesini diseksiyon iğnesi ile sabitleyin. Ardından, yedinci karın segmentini forsepslerle çekerek midgutu çıkarın ve yeni bir mikroskop slaytında% 0.1'lik bir merkürokrom damlacığına aktarın.Bağırsağı sekiz ila 10 dakika lekelenmeye bırakın. Ardından lekeli bağırsağa bir kapak kayması yerleştirin ve 20 ila 40 kat büyütmede parlak alan aydınlatması altında görüntüleyin. Kontrol ve her tedavi grubu için midgut başına ookist sayısını kaydedin.Bu çalışmada, MMV1581558 bileşiğinin, dişi Anopheles gambiae sivrisineklerinin orta bağırsaklarındaki Plasmodium falciparum ookistlerinin sayısını kontrole kıyasla anlamlı derecede kısıtladığı bulunmuştur. Kontrol grubunda, midguttaki ookistlerin ortalama prevalansı% 89 idi ve midgut başına ortalama 9.5 ookist yoğunluğa sahipti. Ancak MMV1581558 ile tedavi edilen grupta, ortalama ookist prevalansı% 36 idi ve midgut başına ortalama yoğunluk sadece 1.5 ookist idi.Böylece, MMV1581558 tedavisi, her üç biyolojik replikasyonda da% 58 iletim bloke edici aktivite% 88 ve% 82 iletim azaltıcı aktivite ile sonuçlandı. Sivrisineklerin sağlıklı bir gametosit kültürüyle beslenmesini sağlamak çok önemlidir. Bunlar olgunlaşmamış gametositler ise veya beşinci aşama gametositler değilse, sivrisineklerde enfeksiyon kapma olasılığı sınırlıdır veya imkansızdır.Tahlil görsel bir morfolojik tanımlama yöntemi kullanır, ancak moleküler niceleme testleri kullanılabilir. Bununla birlikte, bu daha maliyetlidir ve kaynak kısıtlı laboratuvarlarda kullanımlarını sınırlayabilir. Bu tekniği yapabilme yeteneğine sahip olmak, sivrisineklerdeki hemen hemen her şey arasındaki sıtma prevalansının ve yoğunluğunun değişimini değerlendirmek için yeni yollar açar.Örneğin, türlerin vektörel kapasitesinin karşılaştırılması.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em&gt; Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting&gt; ile enfekte Eritrosit

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...