Name: fingerprinting cardiolipin in leukocytes by mass spectrometry for a rapid diagnosis of barth syndrome
Uploaded: 2022-03-23T13:10:00
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Nous sommes reconnaissants aux personnes atteintes de BTHS et à leurs familles d’avoir participé à notre recherche. Nous remercions la Barth Syndrome Foundation US et le Barth Syndrome UK Trust pour leur soutien et pour leur aide à la collecte des échantillons de sang lors de la réunion annuelle à Bristol. Cette étude a été financée par Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus et la région des Pouilles.

Des échantillons de sang de donneurs sains et de patients atteints d’insuffisance cardiaque ont été prélevés à l’hôpital policlinique de Bari (Italie), tandis que des échantillons de patients BTHS ont été prélevés par la clinique BTHS du National Health Service UK au Bristol Royal Hospital for Children (Royaume-Uni). Le consentement éclairé écrit des donneurs, des patients et des parents en bonne santé (le cas échéant) et les approbations des comités d’éthique respectifs ont été obtenus.
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	<li>Barth, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+cardioskeletal+myopathy+and+neutropenia+(Barth+syndrome):+respiratory-chain+abnormalities+in+cultured+fibroblasts.">X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).</li><li>Steward, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=syndrome+(X+linked+cardiac+and+skeletal+myopathy,+neutropenia,+and+organic+aciduria):+rarely+recognised,+frequently+fatal+[abstract].">syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract].</a> Archives of Disease in Childhood. 89, 48 (2004).</li><li>Clarke, S. L. 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M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+useful+MALDI+matrices+for+the+mass+spectrometric+characterization+of+lipids.">Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids.</a> Biomolecules. 8 (4), 173 (2018).</li><li>Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF/MS+analysis+of+archaebacterial+lipids+in+lyophilized+membranes+dry-mixed+with+9-aminoacridine.">MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine.</a> The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).</li><li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+of+intact+mitochondria+by+MALDI-TOF+MS.">Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS.</a> The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).</li><li>Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+method+for+the+determination+of+PC/LPC+ratio+in+intact+horse+serum+by+MALDI-TOF-MS:+an+easy-to-follow+lipid+biomarker+of+inflammation.">A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).</li><li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+fingerprinting+of+leukocytes+by+MALDI-TOF/MS+as+a+screening+tool+for+Barth+syndrome.">Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome.</a> The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).</li><li>Lobasso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipidomic+approach+to+identify+potential+biomarkers+in+exosomes+from+melanoma+cells+with+different+metastatic+potential.">A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential.</a> Frontiers in Physiology. 12, 748895 (2021).</li><li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cholesterol+in+the+brain+by+on-tissue+derivatization+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging.">Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).</li><li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).</li><li>Duncan, M., DeMarco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-MS:+Emerging+roles+in+pathology+and+laboratory+medicine.">MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine.</a> Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).</li></ol>

Le syndrome de Barth est une erreur innée du métabolisme et une condition qui change la vie et qui est susceptible d’être sous-diagnostiquée 2,6. Comme mentionné précédemment, un facteur contributif peut être l’absence d’un test de diagnostic simple. Ici, une méthode simple et rapide pour mesurer le rapport MLCL/CL par MALDI-TOF/MS dans les leucocytes pour le dépistage du BTHS a été décrite. De plus, les spectromètres de masse MALDI-TOF s...

Le syndrome de Barth (BTHS) est une maladie rare liée à l’X caractérisée par une cardiomyopathie précoce, une myopathie musculaire squelettique, un retard de croissance, une neutropénie, un dysfonctionnement variable de la chaîne respiratoire mitochondriale et une structure mitochondriale anormale 1,2,3,4,5. BTHS a une prévalence d’un cas par million d’hommes avec actuellement moins de 250 cas connus dans le monde, bien qu’il soit largement admis que la maladie est sous-diagnostiquée 2,6. BTHS résulte de mutations de perte de fonction du gène Tafazzin (TAFAZZIN) localisé sur le chromosome Xq28.12 7,8 provoquant un remodelage déficient de la cardiolipine phospholipide mitochondriale (CL), un processus qui conduit normalement à une composition acyle hautement symétrique et insaturée 9,10. Cl a été considéré comme le lipide signature des mitochondries, où il est un constituant important de la membrane interne, vital pour la phosphorylation oxydative (c’est-à-dire le métabolisme énergétique mitochondrial), la formation supercomplexe, l’importation de protéines et impliqué dans la dynamique mitochondriale, la mitophagie et l’apoptose 11,12,13,14,15,16 . Lors de la perte de fonction de TAFAZZIN, le remodelage de la CL échoue et des anomalies phospholipidiques spécifiques apparaissent dans les mitochondries des patients BTHS: le niveau de CL mature (CLm) est diminué, tandis que des niveaux accrus de monolysocardiolipine (MLCL) et une composition altérée de CL acyl (c’est-à-dire des espèces cl immatures, CLi) se produisent. Cela entraîne une augmentation spectaculaire du ratio MLCL/CL17.
Le diagnostic de BTHS est souvent difficile, car le trouble présente des caractéristiques cliniques et biochimiques extrêmement variables et peut différer entre les personnes touchées de la même famille et au sein d’un patient au fil du temps 3,5. De nombreux garçons BTHS montrent un niveau très élevé d’excrétion urinaire de l’acide 3-méthylglutaconique (3-MGCA), mais le niveau d’urine peut être normal ou seulement légèrement augmenté chez les patients au cours du temps3. Cependant, l’augmentation de la 3-MGCA est une caractéristique de divers autres troubles mitochondriaux et non mitochondriaux, tels que le déficit en 3-méthylglutaconyl-CoA hydratase (défaut AUH), l’acidurie 3-méthylglutaconique, la dystonie-surdité, l’encéphalopathie, le syndrome de Leigh-like (MEGDEL), le syndrome de Costeff et la cardiomyopathie dilatée avec syndrome d’ataxie (DCMA)18,19 . Par conséquent, la faible spécificité du 3-MCGA en tant que marqueur du BTHS et l’énorme variabilité chez les patients rendent le diagnostic biochimique ambigu.
De plus, plus de 120 mutations différentes de TAFAZZIN ont été décrites à l’origine du trouble5 et, par conséquent, un diagnostic génétique peut être compliqué, lent et coûteux. De plus, l’analyse moléculaire du gène TAFAZZIN peut conduire à des résultats faussement négatifs en présence de mutations dans des séquences non codantes ou régulatrices3. Le BTHS peut être testé sans ambiguïté en déterminant les quantités relatives et la distribution des espèces de (monolyso-)CL et confirmé par le séquençage du gène TAFAZZIN ou vice versa.
Un test pratique pour le diagnostic est la mesure du rapport MLCL / CL par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et électro-pulvérisation ionisation / spectrométrie de masse (ESI / MS) analyse dans la tache de sang 20,21. La mesure du niveau de CL seul n’est pas adéquate pour le diagnostic car certains patients ont des niveaux presque normaux de CL mais un rapport MLCL / CL modifié. Par conséquent, la mesure du rapport MLCL/CL a une sensibilité et une spécificité de 100% pour le diagnostic BTHS21. Une autre méthode validée basée sur l’analyse HPLC et ESI/MS a été mise en place sur les leucocytes22, mais les techniques chromatographiques complexes de séparation des lipides précédemment extraits et le coût des instruments limitent cette analyse à quelques laboratoires cliniques. Tous ces facteurs, ainsi que l’absence d’un test de diagnostic simple, ont contribué au sous-diagnostic de la maladie.
MALDI-TOF/MS est un autre outil valable dans l’analyse des lipides23,24. Cette technique analytique peut être utilisée pour obtenir directement les profils lipidiques de divers échantillons biologiques, sautant ainsi les étapes d’extraction et de séparation 25,26,27,28,29, y compris dans les coupes de tissus pour les applications d’imagerie MS 30. Compte tenu de cet avantage, une méthode simple et rapide de diagnostic du BTHS par profilage de la CL mitochondriale dans des leucocytes intacts avec MALDI-TOF/MS a été développée28. L’isolement des leucocytes à partir de seulement 1 mL de sang total par sédimentation érythrocytaire et lyse est simple et ne nécessite pas d’équipement ou de réactifs spéciaux. De plus, un protocole de « mini-extraction » rapide des lipides applicable à des quantités infimes de leucocytes a été décrit comme justifiant l’acquisition réussie de spectres ayant des signaux MS plus propres avec un rapport signal/bruit (S/N) plus élevé que dans ceux obtenus à partir de leucocytes intacts28. Cette étape supplémentaire prend peu de temps et permet aux analyses d’être reproductibles même lorsqu’elles sont effectuées sur des instruments MS peu sensibles. En résumé, la méthode d’analyse décrite ici nécessite une préparation minimale de l’échantillon, car la séparation chromatographique des lipides, longue et laborieuse, peut être ignorée, accélérant ainsi le test.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;,2,2&#8242;-tetratetradecanoyl cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;2,2&#8242;-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>710335</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>878130</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>830845</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1&#8242;-rac-glycerol)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840445</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840033</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Aminoacridine hemihydrate, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>134410010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>360457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, ACS reagent, &#8805;99.8%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>319988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex Analysis 3.3</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>6505-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, ACS reagent, &#8805;99.0%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fingerprinting cardiolipin in leukocytes by mass spectrometry for a rapid diagnosis of barth syndrome

La cardiolipine (CL), un phospholipide dimérique portant quatre chaînes d’acides gras dans sa structure, est le marqueur lipidique des mitochondries, dans lequel elle joue un rôle crucial dans le fonctionnement de la membrane interne. Son métabolite monolysocardiolipine (MLCL) est physiologiquement presque absent dans l’extrait lipidique des cellules animales et son apparition est la marque du syndrome de Barth (BTHS), une maladie génétique rare et souvent mal diagnostiquée qui provoque une cardiomyopathie sévère dans la petite enfance. La méthode décrite ici génère une « empreinte cardiolipine » et permet un dosage simple des niveaux relatifs des espèces CL et MLCL dans les profils lipidiques cellulaires. Dans le cas des leucocytes, seulement 1 mL de sang est nécessaire pour mesurer le rapport MLCL/CL via l’ionisation de désorption laser assistée par matrice - spectrométrie temps de vol/spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS) juste à moins de 2 h du prélèvement sanguin. Le test est simple et peut être facilement intégré dans le travail de routine d’un laboratoire de biochimie clinique pour dépister le BTHS. Le test montre une sensibilité et une spécificité de 100% pour le BTHS, ce qui en fait un test de diagnostic approprié.

Dans cette étude, une méthode simple et rapide pour isoler les leucocytes de 1 mL de sang total et obtenir l’empreinte CL par MALDI-TOF/MS a été décrite (voir la figure 2). La figure 3 montre la comparaison des empreintes CL représentatives des leucocytes, obtenues chez des sujets témoins et de jeunes garçons BTHS, dans la gamme de masse CL et MLCL (m / z). Le tableau 1 énumère les espèces CL et MLCL détectées dans ces sp...

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Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome

Ce protocole montre comment obtenir une « empreinte » spectrométrique de masse de la cardiolipine leucocytaire pour le diagnostic du syndrome de Barth. L’évaluation du rapport élevé entre la monolysocardiolipine et la cardiolipine distingue les patients atteints du syndrome de Barth des patients témoins atteints d’insuffisance cardiaque avec une sensibilité et une spécificité de 100%.

Prise d’empreintes digitales de la cardiolipine dans les leucocytes par spectrométrie de masse pour un diagnostic rapide du syndrome de Barth

Cardiolipin (CL), a dimeric phospholipid carrying four fatty acid chains in its structure, is the lipid marker of mitochondria, wherein it plays a crucial ...

Cette méthode génère une empreinte digitale cardiolipine des leucocytes par spectrométrie de masse MALDI-TOF et permet de mesurer le rapport entre la monolysocardiolipine et la cardiolipine pour un diagnostic rapide du syndrome de Barth. Le principal avantage de cette technique est la détection d’espèces de lipides diagnostiques par un seul tour de spectrométrie de masse immédiatement après l’isolement des leucocytes d’un millilitre de sang. Ceux-ci, ainsi que la sensibilité et la spécificité oculaires, font de ce test un test de diagnostic approprié à intégrer dans le travail de routine des laboratoires cliniques pour dépister le syndrome de Barth.Commencez par placer des échantillons de sang sur un agitateur orbital pendant 10 minutes. Ensuite, à 0,9 millilitre de sang total dans un tube de 1,5 millilitre, ajoutez 0,1 millilitre de 20% de dextran. Maintenant, pipettez et dispersez doucement la suspension 20 fois tout en évitant les bulles d’air et laissez les globules rouges sédimenter pendant environ une heure à température ambiante.À l’aide d’une seringue, prélever et transférer le surnageant jaune dans un tube de 15 millilitres, puis centrifuger à 400 fois G pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la pastille contenant principalement des leucocytes et des globules rouges résiduels dans 0,6 millilitre d’eau double distillée glacée. Après environ 15 secondes, ajouter 0,2 millilitre de chlorure de potassium 0,6 molaire à la suspension cellulaire pour rétablir l’osmolarité correcte.Le court choc osmotique va lyser les globules rouges et laisser les leucocytes intacts. Réglez ensuite le volume final à 2,5 millilitres avec un PBS à simple intensité. Ensuite, centrifugez la suspension à 400 fois G pendant 15 minutes à température ambiante.Ceci est suivi par l’élimination du surnageant et le lavage de la pastille de leucocyte avec 2,5 millilitres de PBS à force unique. Répéter la centrifugeuse et jeter le surnageant comme décrit précédemment et remettre en suspension la pastille contenant des leucocytes dans 200 microlitres d’eau stérilisée double distillée. Congelez la suspension à moins 80 degrés Celsius ou effectuez directement l’extraction des lipides.Commencez l’extraction en transférant 20 microlitres de suspension de leucocytes dans un tube de 1,5 millilitre et tournez à 16 000 fois G pendant 30 secondes. Après avoir jeté le surnageant, ajouter 10 microlitres de chloroforme à la pastille restante et pipeter à plusieurs reprises pour favoriser l’extraction des lipides. Maintenant, ajoutez 10 microlitres de solution de matrice de 9-aminoacridine à la pastille dans le chloroforme.Pipette et dispersion répétée pour mélanger. Faire tourner la solution contenant des lipides et du chloroforme et une solution matricielle de 9-aminoacridine à 16 000 fois G pendant 30 secondes. Enfin, déposez le surnageant sous forme de gouttelettes de 0,35 microlitre sur la cible MALDI à analyser et laissez sécher les gouttelettes à l’air libre pendant au moins 10 à 15 minutes.Pour l’analyse des lipides, acquérir les spectres de masse des échantillons en triples sur un spectromètre de masse MALDI-TOF. Après étalonnage avec des étalons lipidiques, réglez les analyses en mode ion négatif et optimisez le rapport masse/charge de détection allant de 200 thomson à 2 000 thomson pour l’analyse de petites molécules. Gardez la fluence laser 5% au-dessus du seuil pour avoir un bon rapport signal/bruit.Pour chaque spectre de masse, appliquez en moyenne 2 000 tirs laser simples. Acquérir du spectre en mode réflecteur en utilisant l’extraction pulsée retardée. Appliquez une suspension matricielle fermée à 400 thomson pour éviter la saturation du détecteur.La figure montre que les défauts du gène TAFAZZIN déterminent généralement un profil lipidique spécifique au syndrome de Barth indiqué par l’apparition de formes de monolysocardiolipine et de cardiolipine immature ainsi que par la réduction des formes cardiolipines matures dans l’empreinte cardiolipine. En outre, la figure montre également que les analyses MALDI-TOF/MS des leucocytes de sujets témoins ne présentent généralement que deux espèces de cardiolipine mature. La figure montre que la monolysocardiolipine plus cardiolipine immature sur le rapport cardiolipine mature chez les patients atteints du syndrome de Barth était plus élevée que chez les sujets sains et les patients souffrant d’insuffisance cardiaque.Ici, les groupes témoins et les patients atteints du syndrome de Barth sont séparés par plus d’un ordre de grandeur, ce qui montre que cette méthode a une forte capacité de diagnostic pour le syndrome de Barth. Pour assurer un bon résultat de dosage, il est crucial de suivre attentivement toutes les étapes du protocole, de l’isolement des leucocytes au calcul du rapport monolysocardiolipine/cardiolipine. La spectrométrie de masse MALDI-TOF est utile pour obtenir des profils lipidiques de petites quantités de divers échantillons biologiques afin d’identifier des biomarqueurs lipidiques ou des altérations pathologiques.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

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Biochimie

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