Name: fingerprinting cardiolipin in leukocytes by mass spectrometry for a rapid diagnosis of barth syndrome
Uploaded: 2022-03-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome at JoVE.com

BTHS'li bireylere ve ailelerine araştırmamıza katıldıkları için minnettarız. Barth Sendromu Vakfı ABD ve Barth Sendromu İngiltere Vakfı'na destekleri ve Bristol'deki yıllık toplantıda kan örneklerinin toplanmasına yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Barth Sendromu Vakfı ABD, Barth Italia Onlus ve Apulia Bölgesi tarafından finanse edilmiştir.

Sağlıklı donörlerin ve kalp yetmezliği hastalarının kan örnekleri Bari Poliklinik Hastanesi'nde (İtalya) toplanırken, BTHS hastalarının örnekleri Bristol Royal Çocuk Hastanesi'ndeki (İngiltere) Ulusal Sağlık Hizmeti İngiltere BTHS kliniği tarafından elde edildi. Sağlıklı donörlerin, hastaların ve ebeveynlerin (uygun olduğunda) yazılı bilgilendirilmiş onamları ve ilgili etik kurulların onayları alınmıştır.
NOT: Hemen kullanılmazsa, kan (K-EDTA jel tüpünde)...

<ol>
	<li>Barth, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+cardioskeletal+myopathy+and+neutropenia+(Barth+syndrome):+respiratory-chain+abnormalities+in+cultured+fibroblasts.">X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).</li><li>Steward, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=syndrome+(X+linked+cardiac+and+skeletal+myopathy,+neutropenia,+and+organic+aciduria):+rarely+recognised,+frequently+fatal+[abstract].">syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract].</a> Archives of Disease in Childhood. 89, 48 (2004).</li><li>Clarke, S. L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barth+syndrome.">Barth syndrome.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23 (2013).</li><li>Zegallai, H. M., Hatch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barth+syndrome:+cardiolipin,+cellular+pathophysiology,+management,+and+novel+therapeutic+targets.">Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).</li><li>Taylor, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+presentation+and+natural+history+of+Barth+Syndrome:+An+overview.">Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).</li><li>Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+analysis+to+determine+the+prevalence+of+Barth+syndrome+in+the+pediatric+population.">Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population.</a> The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).</li><li>Bione, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+X-linked+gene,+G4.5.+is+responsible+for+Barth+syndrome.">A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome.</a> Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).</li><li>Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+functional+classes+of+Barth+Syndrome+mutation.">Seven functional classes of Barth Syndrome mutation.</a> Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).</li><li>Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+symmetry+in+mitochondrial+cardiolipins.">Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).</li><li>Schlame, M., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+Tafazzin,+a+mitochondrial+phospholipid-lysophospholipid+acyltransferase.">The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).</li><li>Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+and+functional+role+of+cardiolipin.">The biosynthesis and functional role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).</li><li>Mileykovskaya, E., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+membrane+domains+in+prokaryotes+and+eukaryotes.">Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).</li><li>Claypool, S. M., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity+of+cardiolipin+in+health+and+disease.">The complexity of cardiolipin in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).</li><li>Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+mitochondrial+cardiolipin.">Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).</li><li>Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cardiolipin+in+mitochondrial+function+and+dynamics+in+health+and+disease:+Molecular+and+pharmacological+aspects.">Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects.</a> Cells. 8 (7), 728 (2019).</li><li>Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+ebb+and+flow+makes+mitochondria+go.">Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131 (2020).</li><li>Schlame, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+abnormalities+in+children+with+Barth+syndrome.">Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).</li><li>Wortmann, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+with+3-methylglutaconic+aciduria+as+discriminative+feature:+proper+classification+and+nomenclature.">Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).</li><li>Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+3-methylglutaconic+acid+in+disorders+of+mitochondrial+energy+metabolism.">On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).</li><li>Kulik, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bloodspot+assay+using+HPLC-tandem+mass+spectrometry+for+detection+of+Barth+syndrome.">Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome.</a> Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).</li><li>Vaz, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+functional+assay+in+blood+spot+to+diagnose+Barth+syndrome+using+the+monolysocardiolipin/cardiolipin+ratio.">An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).</li><li>Bowron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Barth+syndrome+using+a+novel+LC-MS/MS+method+for+leukocyte+cardiolipin+analysis.">Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometric+analysis+of+cellular+glycerophospholipids+enabled+by+multiplexed+solvent+dependent+analyte-matrix+interactions.">Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).</li><li>Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+useful+MALDI+matrices+for+the+mass+spectrometric+characterization+of+lipids.">Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids.</a> Biomolecules. 8 (4), 173 (2018).</li><li>Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF/MS+analysis+of+archaebacterial+lipids+in+lyophilized+membranes+dry-mixed+with+9-aminoacridine.">MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine.</a> The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).</li><li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+of+intact+mitochondria+by+MALDI-TOF+MS.">Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS.</a> The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).</li><li>Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+method+for+the+determination+of+PC/LPC+ratio+in+intact+horse+serum+by+MALDI-TOF-MS:+an+easy-to-follow+lipid+biomarker+of+inflammation.">A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).</li><li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+fingerprinting+of+leukocytes+by+MALDI-TOF/MS+as+a+screening+tool+for+Barth+syndrome.">Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome.</a> The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).</li><li>Lobasso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipidomic+approach+to+identify+potential+biomarkers+in+exosomes+from+melanoma+cells+with+different+metastatic+potential.">A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential.</a> Frontiers in Physiology. 12, 748895 (2021).</li><li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cholesterol+in+the+brain+by+on-tissue+derivatization+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging.">Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).</li><li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).</li><li>Duncan, M., DeMarco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-MS:+Emerging+roles+in+pathology+and+laboratory+medicine.">MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine.</a> Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).</li></ol>

Barth sendromu, doğuştan gelen bir metabolizma hatası ve 2,6'nın az teşhis edilmesi muhtemel olan yaşamı değiştiren bir durumdur. Daha önce de belirtildiği gibi, katkıda bulunan bir faktör, basit bir tanı testinin olmaması olabilir. Burada, BTHS taraması için lökositlerde MLCL / CL oranını MALDI-TOF / MS ile ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem tanımlanmıştır. Ayrıca, MALDI-TOF kütle spektrometreleri dünya çapında klinik l...

Barth sendromu (BTH), erken başlangıçlı kardiyomiyopati, iskelet kası miyopatisi, büyüme gecikmesi, nötropeni, değişken mitokondriyal solunum zinciri disfonksiyonu ve anormal mitokondriyal yapı 1,2,3,4,5 ile karakterize nadir görülen X'e bağlı bir hastalıktır. BTHS, şu anda dünya çapında bilinen 250'den az vaka ile milyon erkek başına bir vaka prevalansına sahiptir, ancak hastalığın 2,6 tanısının az olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. BTHS, Xq28.127,8 kromozomuna lokalize olan Tafazzin (TAFAZZIN) geninin fonksiyon kaybı mutasyonlarından kaynaklanır ve mitokondriyal fosfolipid kardiyolipinin (CL) eksik yeniden şekillenmesine neden olur, bu da normalde oldukça simetrik ve doymamış bir açil bileşimine yol açan bir süreç 9,10'dur. CL, oksidatif fosforilasyon (yani mitokondriyal enerji metabolizması), süperkompleks oluşumu, protein ithalatı için hayati önem taşıyan ve mitokondriyal dinamikler, mitofaji ve apoptoz 11,12,13,14,15,16 için hayati önem taşıyan iç zarın önemli bir bileşeni olduğu mitokondrinin imza lipiti olarak kabul edilmiştir. . TAFAZZIN'in fonksiyon kaybı üzerine, CL yeniden şekillenmesi başarısız olur ve BTHS hastalarının mitokondrilerinde spesifik fosfolipid anormallikleri ortaya çıkar: olgun CL seviyesi (CLm) azalırken, monolizokardiyolipin (MLCL) ve değişmiş CL açil bileşimi (yani, olgunlaşmamış CL türleri, CLi) düzeylerinde artış meydana gelir. Bu, MLCL / CL oranının17'sinde çarpıcı bir artışa neden olur.
BTHS tanısı genellikle zordur, çünkü bozukluk son derece değişken klinik ve biyokimyasal özellikler gösterir ve aynı aileden etkilenen bireyler arasında ve zaman içinde bir hasta içinde farklılık gösterebilir 3,5. Birçok BTHS erkek çocuğu, 3-metilglutakonik asidin (3-MGCA) idrar atılımının çok yüksek bir seviyesini gösterir, ancak idrar seviyesi normal olabilir veya zamanla hastalarda sadece hafif bir şekilde artabilir3. Bununla birlikte, artmış 3-MGCA, 3-metilglutakonil-CoA hidrataz eksikliği (AUH defekti), 3-metilglutakonik asidüri, distoni-sağırlık, ensefalopati, Leigh benzeri (MEGDEL) sendromu, Costeff sendromu ve ataksi (DCMA) sendromu ile dilate kardiyomiyopati gibi diğer çeşitli mitokondriyal ve mitokondriyal olmayan bozuklukların bir özelliğidir18,19 . Bu nedenle, BTHS için bir belirteç olarak 3-MCGA'nın zayıf özgüllüğü ve hastalardaki muazzam değişkenlik, biyokimyasal tanıyı belirsiz hale getirmektedir.
Ayrıca,bozukluğa neden olan 120'den fazla farklı TAFAZZIN mutasyonu tanımlanmıştır 5 ve bu nedenle genetik tanı karmaşık, yavaş ve pahalı olabilir. Ayrıca, TAFAZZIN geninin moleküler analizi, kodlamayan veya düzenleyen dizilerdeki mutasyonların varlığında yanlış negatif sonuçlara yol açabilir3. BTHS, (monolizo-) CL türlerinin nispi miktarları ve dağılımı belirlenerek açık bir şekilde test edilebilir ve TAFAZZIN gen dizilimi ile doğrulanabilir veya bunun tersi de geçerlidir.
Tanı için pratik bir test, MLCL / CL oranının Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ve Elektro Sprey İyonizasyon / Kütle spektrometrisi (ESI / MS) analizi ile kan noktası20,21'de ölçülmesidir. Bazı hastalarda normale yakın CL düzeyleri olduğu halde MLCL/CL oranı değiştiği için CL düzeyinin ölçülmesi tek başına tanı için yeterli değildir. Bu nedenle MLCL/CL oranının ölçümü BTHS tanısı için %100 duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir21. HPLC ve ESI/MS analizine dayanan bir başka doğrulanmış yöntem lökositler22 üzerinde kurulmuştur, ancak daha önce ekstrakte edilen lipitlerin ayrılması için karmaşık kromatografik teknikler ve cihazların pahalılığı bu analizi birkaç klinik laboratuvarla sınırlandırmaktadır. Tüm bu faktörler, basit bir tanı testinin eksikliği ile birlikte, durumun yetersiz teşhisine katkıda bulunmuştur.
MALDI-TOF/MS, lipid analizinde23,24 bir başka geçerli araçtır. Bu analitik teknik, çeşitli biyolojik örneklerin lipit profillerini doğrudan elde etmek için kullanılabilir, böylece MS Görüntüleme uygulamaları için doku kesitleri de dahil olmak üzere ekstraksiyon ve ayırma adımları25,26,27,28,29 atlanır 30. Bu avantaj göz önüne alındığında, MALDI-TOF / MS ile sağlam lökositlerde mitokondriyal CL'nin profilini çıkararak BTHS'yi teşhis etmek için basit ve hızlı bir yöntem geliştirilmiştir28. Eritrosit sedimantasyonu ve lizis ile sadece 1 mL tam kandan lökosit izolasyonu basittir ve özel ekipman veya reaktif gerektirmez. Ayrıca, küçük miktarlarda lökositlere uygulanan hızlı bir lipit "mini ekstraksiyon" protokolü, bozulmamış lökositlerden elde edilenlerden daha yüksek sinyal-gürültü oranına (S / N) sahip daha temiz MS sinyallerine sahip spektrumların başarılı bir şekilde elde edilmesini garanti etmek için tanımlanmıştır28. Bu ileri adım çok az zaman alır ve analizlerin zayıf hassasiyete sahip MS cihazlarında gerçekleştirildiğinde bile tekrarlanabilir olmasını sağlar. Özetle, burada açıklanan analitik yöntem minimum numune hazırlama gerektirir, çünkü zaman alıcı ve emek yoğun kromatografik lipit ayrımı atlanabilir, böylece test hızlandırılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;,2,2&#8242;-tetratetradecanoyl cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;2,2&#8242;-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>710335</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>878130</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>830845</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1&#8242;-rac-glycerol)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840445</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840033</td>
			<td>Lipid standard for MALDI-TOF calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Aminoacridine hemihydrate, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>134410010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>360457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, ACS reagent, &#8805;99.8%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>319988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex Analysis 3.3</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>6505-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, ACS reagent, &#8805;99.0%</td>
			<td>Merck Life Science S.r.l.</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fingerprinting cardiolipin in leukocytes by mass spectrometry for a rapid diagnosis of barth syndrome

Yapısında dört yağ asidi zinciri taşıyan dimerik bir fosfolipid olan kardiyolipin (CL), mitokondrinin lipit belirtecidir ve burada iç zarın işleyişinde çok önemli bir rol oynar. Metaboliti monolizokardiyolipin (MLCL), hayvan hücrelerinin lipit ekstraktında fizyolojik olarak neredeyse yoktur ve görünümü, bebeklik döneminde ciddi kardiyomiyopatiye neden olan nadir ve sıklıkla yanlış teşhis edilen bir genetik hastalık olan Barth sendromunun (BTHS) ayırt edici özelliğidir. Burada açıklanan yöntem bir "kardiyolipin parmak izi" oluşturur ve hücresel lipit profillerinde CL ve MLCL türlerinin göreceli seviyelerinin basit bir analizine izin verir. Lökositler söz konusu olduğunda, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyonu - uçuş süresi / kütle spektrometrisi ( MALDI-TOF / MS) yoluyla MLCL / CL oranını ölçmek için sadece 1 mL kan gerekir. Tahlil basittir ve BTHS'yi taramak için bir klinik biyokimya laboratuvarının rutin çalışmalarına kolayca entegre edilebilir. Test, BTHS için% 100 duyarlılık ve özgüllük gösterir ve bu da onu uygun bir tanı testi haline getirir.

Bu çalışmada, lökositlerin 1 mL tam kandan izole edilmesi ve MALDI-TOF/MS ile CL parmak izinin alınması için basit ve hızlı bir yöntem tanımlanmıştır (bkz. Şekil 2). Şekil 3 , kontrol deneklerinden ve BTHS genç erkeklerinden elde edilen lökositlerin temsili CL parmak izinin CL ve MLCL kütle (m / z) aralığında karşılaştırılmasını göstermektedir. Tablo 1 , bu kütle spektrumlarında tespit edilen CL ve MLCL t...

Watch this Scientific Journal Video about Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome at JoVE.com

Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome

Bu protokol, Barth sendromunun teşhisi için lökosit kardiyolipinin kütle spektrometrik "parmak izinin" nasıl elde edileceğini göstermektedir. Yüksek monolizokardiyolipin-kardiyolipin oranının değerlendirilmesi, Barth sendromlu hastaları %100 duyarlılık ve özgüllüğü olan kontrol kalp yetmezliği hastalarından ayırmaktadır.

Barth Sendromunun Hızlı Teşhisi için Lökositlerde Kardiyolipinin Kütle Spektrometresi ile Parmak İzi Alınması

Cardiolipin (CL), a dimeric phospholipid carrying four fatty acid chains in its structure, is the lipid marker of mitochondria, wherein it plays a crucial ...

Bu yöntem, MALDI-TOF kütle spektrometresi ile lökositlerin kardiyolipin parmak izini oluşturur ve Barth sendromunun hızlı teşhisi için monolizokardiyolipin ve kardiyolipin arasındaki oranın ölçülmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, lökositlerin bir mililitre kandan izole edilmesinden hemen sonra tanısal lipit türlerinin tek bir kütle spektrometresi turu ile tespit edilmesidir. Bunlar ve göz duyarlılığı ve özgüllüğü, bu tahlili Barth sendromunu taramak için klinik laboratuvarların rutin çalışmalarına entegre edilecek uygun bir tanı testi haline getirmektedir.Kan örneklerini 10 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirerek başlayın. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir tüpte 0.9 mililitre tam kana, 0.1 mililitre% 20dekstran ekleyin. Şimdi pipet ve hava kabarcıklarından kaçınırken süspansiyonu nazikçe 20 kez dağıtın ve RBC'lerin oda sıcaklığında yaklaşık bir saat tortu bırakmasına izin verin.Bir şırınga kullanarak, sarı süpernatantı toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, esas olarak lökositler ve artık RBC'ler içeren peleti 0.6 mililitre buz gibi soğuk çift damıtılmış suda yeniden askıya alın. Yaklaşık 15 saniye sonra, doğru ozmolariteyi geri kazanmak için hücre süspansiyonuna 0.2 mililitre 0.6 molar potasyum klorür ekleyin.Kısa ozmotik şok RBC'yi lize edecek ve lökositleri sağlam bırakacaktır. Ardından, son ses seviyesini tek mukavemetli PBS ile 2,5 mililitreye ayarlayın. Daha sonra, süspansiyonu oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüj yapın.Bunu, süpernatantın atılması ve lökosit peletinin 2.5 mililitre tek mukavemetli PBS ile yeniden yıkanması izler. Santrifüjü tekrarlayın ve süpernatantı daha önce tarif edildiği gibi atın ve lökosit içeren peleti 200 mikrolitre sterilize edilmiş çift damıtılmış suda yeniden askıya alın. Süspansiyonu eksi 80 santigrat derecede dondurun veya doğrudan lipit ekstraksiyonu gerçekleştirin.20 mikrolitre lökosit süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktararak ekstraksiyona başlayın ve 30 saniye boyunca 16.000 kez G'de döndürün. Süpernatanı attıktan sonra, kalan pelete 10 mikrolitre kloroform ekleyin ve lipit ekstraksiyonunu teşvik etmek için tekrar tekrar pipet ekleyin. Şimdi, kloroformdaki pelete 10 mikrolitre 9-aminoakridin matris çözeltisi ekleyin.Pipet ve karıştırmak için tekrar tekrar dağıtın. Lipitler ve kloroform ve 9-aminoakridin matris çözeltisi içeren çözeltiyi 30 saniye boyunca 16.000 kez G'de döndürün. Son olarak, süpernatantı analiz edilecek MALDI hedefine 0.35 mikrolitrelik damlacıklar halinde koyun ve damlacıkların havasının en az 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin.Lipid analizi için, bir MALDI-TOF kütle spektrometresinde üçlü olarak numunelerin kütle spektrumlarını elde edin. Lipid standartlarıyla kalibrasyondan sonra, analizleri negatif iyon modunda ayarlayın ve küçük molekül analizi için 200 thomson ile 2.000 thomson arasındaki algılama kütle-yük oranı aralığını optimize edin. İyi bir sinyal-gürültü oranına sahip olmak için lazer akıcılığını eşiğin% 5 üzerinde tutun.Her kütle spektrumu için ortalama 2.000 tek lazer atışı uygulayın. Gecikmeli darbeli ekstraksiyonu kullanarak reflektör modunda spektrum elde edin. Dedektör doygunluğunu önlemek için 400 thomson'a kapılı matris süspansiyonu uygulayın.Şekil, TAFAZZIN genindeki kusurların tipik olarak, monolizokardiyolipin ve olgunlaşmamış kardiyolipin formlarının ortaya çıkmasıyla belirtilen Barth sendromuna özgü bir lipit profilini belirlediğini ve kardiyolipin parmak izindeki olgun kardiyolipin formlarının azaltılmasını göstermektedir. Ayrıca, şekil ayrıca, kontrol deneklerinin lökositlerinin MALDI-TOF / MS analizlerinin tipik olarak sadece iki tür olgun kardiyolipin sergilediğini göstermektedir. Şekil, Barth sendromlu hastalar için olgun kardiyolipin oranında monolizokardiyolipin artı olgunlaşmamış kardiyolipinin sağlıklı deneklerden ve kalp yetmezliği hastalarına göre daha yüksek olduğunu göstermektedir.Burada, kontrol grupları ve Barth sendromu hastaları birden fazla büyüklük sırasına göre ayrılır ve bu yöntemin Barth sendromu için güçlü bir tanı yeteneğine sahip olduğunu gösterir. İyi bir tahlil sonucu elde etmek için, lökosit izolasyonundan monolizokardiyolipin-kardiyolipin oranı hesaplamasına kadar tüm protokol adımlarını dikkatlice takip etmek çok önemlidir. MALDI-TOF kütle spektrometresi, lipid biyobelirteçlerini veya patolojik değişiklikleri tanımlamak için az miktarda çeşitli biyolojik örneklerin lipit profillerinin elde edilmesinde yararlıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biyokimya

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...