Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

Arbejdet blev delvist støttet af NIH-bevilling R01 AR060456 (FL). Vi takker Dr. Michael Robinson og Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) for deres generøse hjælp med scintillationstælleren.

Anvendelsen af radioaktive materialer (RAM) kræver forudgående godkendelse fra et udpeget sikkerhedsudvalg ved hver institution. RAM'er, der anvendes i denne protokol, er blevet godkendt af Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) ved University of Pennsylvania. Anvendelsen af dyr kræver forudgående godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på hjemmeinstitutionen. Følgende undersøgelse blev godkendt af IACUC på The Children's Hospital of Philadelphia.
<str...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus.">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li><li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids,+ketone+bodies+and+pyruvate,+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation,+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles.">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists.">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li><li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+osteoblast:+implications+for+osteoporosis.">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation.">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li><li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

Protokollen giver en brugervenlig metode til at bestemme oxidationshastigheden for større energisubstrater. Det er et enklere alternativ til andre protokoller, der bruger kolber, der indeholder en central brønd og er dækket af gummipropper 14,15,16. Selvom eksempelstudiet her udføres med cellekultur, kan metoden let tilpasses vævseksplanter eller vævshomogenater indeholdende intakte mitokondrier, som tidligere beskrevet<su...

Oxidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter er den proces, hvorved næringsstoffer nedbrydes inde i mitokondrier for at frigive kemisk energi i form af ATP gennem forbrug af ilt.  Katabolisme af forskellige substrater inde i mitokondrier gennem tricarboxylsyre (TCA) cyklus genererer få ATP molekyler direkte, men lagrer snarere energi gennem reduktion af elektronbærerne nicotinamid adenin dinukleotid (NAD +) og flavinadenin dinukleotid (FAD +). De reducerede bærere oxideres derefter af ETC placeret på mitokondriernes indre membran for at generere en protonkoncentrationsgradient over membranen. Protonerne strømmer til sidst ned ad deres gradient tilbage i mitokondrielle matrix gennem ATP-syntase for at producere ATP. OXPHOS er det mest effektive middel til ATP-produktion fra energisubstrater og foretrækkes generelt i aerobe miljøer. Tidligere blev aerob glykolyse - produktion af laktat fra glukose, mens ilt er til stede - anset for at være patofysiologisk, ofte et kendetegn for kræftceller. Mere og mere opdages det, at nogle normale celletyper bruger aerob glykolyse af grunde, der endnu ikke er fuldt dechiffreret.
Metabolisk fleksibilitet er cellers eller organismers evne til at tilpasse sig skiftende energibehov og tilgængelige brændstofkilder. For eksempel imødekommes den energiske efterspørgsel efter skeletmuskulatur hovedsageligt af OXPHOS ved steady state, men af anaerob glykolyse under træning med høj intensitet1. Efterhånden som træningsvarigheden øges, bidrager glukose og fedtsyreoxidation mere til den samlede energiproduktion2. Imidlertid er substratbrug ikke kun afhængig af tilgængelighed, da substrater antagonistisk konkurrerer under oxidation. Mest bemærkelsesværdigt har fedtsyreoxidation vist sig at hæmme glukoseudnyttelsen af skeletmuskulaturen i et fænomen kendt som Randle-effekten3. En gensidig effekt blev påvist ved efterfølgende undersøgelser 4,5. Derudover er mange sygdomme forbundet med en ændring i substratpræference og udviklingen af metabolisk ufleksibilitet i celler. For eksempel reduceres fedtsyreoxidation i skeletmuskulaturen hos type II-diabetespatienter sammenlignet med normale kontrolpersoner6. De metaboliske ændringer i sygdomsindstillinger er genstand for intens undersøgelse, da de kan bidrage til patogenese.
Energimetabolisme i skeletcelletyper er relativt underundersøgt, men har fået opmærksomhed i de senere år7. Tidligere arbejde har vist, at aerob glykolyse er den dominerende energivej i kalvariale osteoblaster, mens glukoseoxidation gennem TCA-cyklussen spiller en rolle i osteoklastdannelse 8,9. Andre har fremlagt beviser for fedtsyrer som energikilde til osteoblaster10. Glutaminkatabolisme har også vist sig at understøtte osteoblastdifferentiering fra forfædrene11,12. Imidlertid mangler der stadig en omfattende forståelse af substratudnyttelse af forskellige skeletcelletyper. Derudover forventes ændringer i cellulær metabolisme under celledifferentiering eller som reaktion på patologiske signaler at ændre udnyttelsen af brændstofsubstratet. Beskrevet nedenfor er en brugervenlig protokol til analyse af substratoxidation in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

Mitokondrier er vært for maskineriet til tricarboxylsyre (TCA) cyklus og elektrontransportkæde (ETC), som genererer adenosintrifosfat (ATP) for at opretholde energihomeostase. Glukose, fedtsyrer og aminosyrer er de vigtigste energisubstrater, der brænder mitokondriel respiration i de fleste somatiske celler. Beviser viser, at forskellige celletyper kan have en særskilt præference for visse substrater. Imidlertid er substratudnyttelse af forskellige celler i skelettet ikke blevet undersøgt i detaljer. Da cellulær metabolisme er tilpasset fysiologiske og patofysiologiske ændringer, kan direkte vurderinger af substratafhængighed i skeletceller desuden give vigtig indsigt i patogenesen af knoglesygdomme.
Følgende protokol er baseret på princippet om frigivelse af kuldioxid fra substratmolekyler efter oxidativ phosphorylering. Ved at anvende substrater, der indeholder radioaktivt mærkede carbonatomer (14C), tilvejebringer metoden et følsomt og brugervenligt assay for hastigheden af substratoxidation i cellekultur. Et casestudie med primære kalvariale preosteoblaster versus knoglemarvsafledte makrofager (BMM'er) viser forskellig udnyttelse af hovedsubstraterne mellem de to celletyper.

I dette eksempel anvendes CO2 - fangstmetoden til at sammenligne substratoxidation ved primære kalvariale preosteoblaster versus BMM'er, som ofte anvendes til henholdsvis in vitro osteoblast eller osteoklastdifferentiering. Efter at de primære celler er passeret og dyrket i cMEMα natten over, når de typisk 80-90% af sammenløbet og udviser deres karakteristiske morfologi. De kalvariale preosteoblaster er især større end BMM'er (figur 2). Hver celletype udsættes for...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Denne protokol beskriver en brugervenlig metode til at undersøge substratoxidation ved at spore 14CO2 -produktion in vitro.

Vurdering af oxidation af energisubstrat in vitro med 14CO2 - fangst

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

Anvendelsen af forskellige energisubstrater er både celletypespecifik og sygdomsdedikativ. Måling af forbruget af de specifikke substrater kan kaste lys over både normal biologi og patologi. Teknikken behøver ikke specialudstyr og er let at skalere.Det er også lettere at bruge end tidligere offentliggjorte metoder. Forståelse af ændringer i substratoxidationshastigheden vil muliggøre udvikling af diæt- og farmakologiske interventioner til metaboliske lidelser. Selvom det er demonstreret med knoglevæv, er denne teknik let tilpasset til at studere metabolisk fleksibilitet i alle celletyper, hvilket giver en forståelse af både årsagerne til og konsekvenserne af metaboliske skift.Efter at have ofret hvalpene på tre til fem postnatale dage, overfør dem til iskold D PBS indeholdende penicillin streptomycin dobbelt antibiotikaopløsning. Udsæt calvaria ved at fjerne huden og blødt væv. Saml det midterste område ved at skære det omgivende væv fra ryg til front i D PBS.Rids de indre og ydre overflader af calvaria forsigtigt ved hjælp af pincet for at hjælpe med at frigive cellerne ved efterfølgende fordøjelse. Der fremstilles 2 og 4 milligram pr. milliliter opløsninger af collagenase type to i D PBS og filtreres hver opløsning med et nyt 0,22 mikrometer filter. Først fordøjes den rensede calvaria med to milligram pr. Milliliter kollagenaseopløsning i 15 minutter, og kassér derefter fordøjelsesopløsningen.Derefter fordøjes de rene prøver i fire milligram pr. Milliliter kollagenaseopløsning tre gange i 15 minutter hver gang. Træk derefter fordøjelsesopløsningen og gem den. Filtrer fordøjelsesopløsningen gennem 70 mikrometer cellesiler, og centrifuger filtratet ved 300 RCF i fem minutter.Re suspendere cellepillen i komplet MEM alfa-medium indeholdende 10% FBS og penicillin streptomycin dobbelt antibiotikaopløsning. Tæl og frø cellerne i en 10 centimeter plade. Kultur cellerne i en 37 grader Celsius inkubator med 5% kuldioxid i tre dage.Derefter dissocieres cellerne ved 37 grader Celsius med 0,25 Trypsin EDTA. Efter fordøjelsen tælles og frøes cellerne i en 24 brøndcellekulturplade med et komplet MEM alfa-medium indeholdende 10% FBS og penicillin streptomycin dobbelt antibiotikaopløsning. Frø mindst fire brønde pr. celletype pr. substrat og mindst tre ekstra brønde for hver celletype til tælling før analyse.Kultur cellerne ved 37 grader Celsius natten over. Efter at have fjernet muskler og bindevæv fra otte uger gamle mus og samlet lårben og skinneben, skal du klippe og kassere begge ender af knoglerne med en skarp saks. Skyl knoglemarven ud fra et lårben og et skinneben i en frisk 10 centimeter petriskål med en sprøjte udstyret med en 23 gauge nål indeholdende 15 ml komplet MEM alfa-medium med 10% FBS penicillin streptomycin dobbelt antibiotikaopløsning og 10% CGM 14 12 konditioneret medium.Kultur cellerne i petriskålen i en 37 grader Celsius inkubator med 5% kuldioxid. Efter tre dage kasseres kulturmediet og skylles cellerne med D PBS. Dissocier de vedhæftede celler ved 37 grader Celsius med 0,25% Trypsin EDTA i fem minutter.Efter centrifugering suspenderes cellepillen i BMM-mediet. Tæl og frø cellerne i en 24 brøndcellekulturplade i henhold til den tidligere beskrevne procedure. Kultur ved 37 grader Celsius natten over i BMM-mediet, inden analyserne påbegyndes.Vask cellerne i de ekstra brønde to gange med D PBS. Dissociere cellerne med 0,25% Trypsin EDTA. Re suspendere 20 mikroliter fordøjede celler i D PBS.Med 20 mikroliter acridin orange og propidiumiodidfarvestofopløsning bestemmes antallet af levende celler med en automatiseret celletæller og registreres antallet. Vask cellerne i analysebrøndene to gange med D PBS. Tilsæt 500 mikroliter varmt medium til hvert assay godt i den RAM-udpegede vævskulturhætte.Efter forsegling af pladen med parafilm inkuberes cellerne i en RAM-udpeget inkubator ved 37 grader Celsius i 4 timer. Under inkubation skæres filterpapir i cirkulære stykker, lidt større end området inde i hætten på 1,5 ml mikrocentrifugerøret og indsættes papiret tæt ind i hætten. Tilsæt 200 mikroliter en 1 molær perchlorsyre til hvert rør og 20 mikroliter natriumhydroxid til filterpapiret, der er monteret inde i hætten.Efter inkubation af cellerne overføres 400 mikroliter dyrkningsmedium fra hver brønd til de forberedte rør og lukkes straks hætterne. Lad rørene stå i et rørstativ ved stuetemperatur i en time. Parallelae under inkubation opsatte et hætteglas med scintillation for hvert rør og fyldte det med fire milliliter scintillationsvæske.Overfør hvert stykke filterpapir til et hætteglas med scintillation og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Udfør aftørringstest på vævskulturhætten, vandbadet, køleskabet, inkubatoren, vasken, jorden og ethvert andet arbejdsområde for potentiel RAM-forurening. Sæt papirservietterne i hætteglas med scintillation, der indeholder scintillationsvæske.Mål kulstof 14-radioaktivitet i hætteglassene med scintillation med en scintillationstæller, og registrer læseresultaterne. Dekontaminere arbejdsmiljøet i henhold til retningslinjer for strålingssikkerhed, hvis det er nødvendigt. Figuren sammenligner substratoxidation ved primære calvaria præ osteoblaster versus BMM'er.Efter at de primære celler er passeret og dyrket i komplet MEM alfa-medium natten over, når de typisk 80 til 90% sammenflydende og udviser deres karakteristiske morfologi. De kalvariale præ-osteoblaster er især større end BMM'er. Resultaterne af substratoxidation viste, at oxidationshastigheden for hvert substrat er signifikant højere i kalvariale præosteoblaster end BMM'er, hvilket sandsynligvis indikerer højere energiproduktion ved oxidativ phosphorylering i præ-osteoblasterne.Det indsatte tredje papir skal være lidt større end en 1,7 ml ebin top tube cap. Denne metode kan anvendes i forbindelse med iltforbrug og til at bestemme den samlede hastighed af oxidativ fosforylering og laktativ produktion i cellerne. Denne protokol kan bruges til at bestemme substratbrug under forskellige differentieringsstadier eller sygdomsindstillinger.Med denne viden kan vi udvikle interventioner for stofskiftesygdomme.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time overvågning af ligand-receptor interaktioner med Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Gene Trapping Brug Gal4 i zebrafisk

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bestemmelse af fedtsyreoxidation og lipogenese i Mus primære hepatocytter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling af energimetabolisme i eksplanterede retinale væv ved hjælp af ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Vurdering af mineraltilgængelighed i fiskefoder ved hjælp af komplementære metoder demonstreret med eksemplet med zink i atlanterhavslaks

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Vurdering af proteininteraktioner i levende celler med FRET-sensibiliseret emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Måling mitokondrie substrat flux i rekombinant perfringolysin O-Permeabilized celler

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Bestemmelse af basalenergiudgifter og de termogeniske adipocytters evne til at forbruge energi i overvægtige mus

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Anvendelse af passiv hovedbevægelse til at generere definerede accelerationer ved gnaverhovederne på gnavere

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...