Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

Le travail a été soutenu en partie par la subvention R01 AR060456 (FL) des NIH. Nous remercions le Dr Michael Robinson et Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) pour leur généreuse aide avec le compteur de scintillation.

L’utilisation de matières radioactives (RAM) nécessite l’approbation préalable d’un comité de sûreté désigné dans chaque établissement. Les RAM utilisés dans ce protocole ont été approuvés par Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) de l’Université de Pennsylvanie. L’utilisation d’animaux nécessite l’approbation préalable du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement d’origine. L’étude suivante a été approuvée par l’IACUC à ...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus.">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li><li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids,+ketone+bodies+and+pyruvate,+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation,+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles.">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists.">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li><li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+osteoblast:+implications+for+osteoporosis.">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation.">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li><li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

Le protocole fournit une méthode facile à utiliser pour déterminer le taux d’oxydation des principaux substrats énergétiques. C’est une alternative plus simple aux autres protocoles qui utilisent des flacons contenant un puits central et coiffés de bouchons en caoutchouc 14,15,16. Bien que l’exemple d’étude ici soit réalisé avec une culture cellulaire, la méthode peut être facilement adaptée pour les explante...

La phosphorylation oxydative (OXPHOS) chez les eucaryotes est le processus par lequel les nutriments sont décomposés à l’intérieur des mitochondries pour libérer de l’énergie chimique sous forme d’ATP par la consommation d’oxygène.  Le catabolisme de divers substrats à l’intérieur des mitochondries par le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) génère directement peu de molécules d’ATP, mais stocke plutôt de l’énergie par réduction des transporteurs d’électrons nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et flavine adénine dinucléotide (FAD+). Les porteurs réduits sont ensuite oxydés par ETC situé sur la membrane interne des mitochondries pour générer un gradient de concentration de protons à travers la membrane. Les protons finissent par descendre leur gradient dans la matrice mitochondriale à travers l’ATP synthase pour produire de l’ATP. OXPHOS est le moyen le plus efficace de production d’ATP à partir de substrats énergétiques et généralement préféré dans les environnements aérobies. Auparavant, la glycolyse aérobie - la production de lactate à partir du glucose alors que l’oxygène est présent - était considérée comme physiopathologique, souvent une caractéristique des cellules cancéreuses. De plus en plus, on découvre que certains types de cellules normales utilisent la glycolyse aérobie pour des raisons qui n’ont pas encore été entièrement déchiffrées.
La flexibilité métabolique est la capacité des cellules ou des organismes à s’adapter à l’évolution des demandes d’énergie et des sources de carburant disponibles. Par exemple, la demande énergétique du muscle squelettique est principalement satisfaite par OXPHOS à l’état d’équilibre mais par la glycolyse anaérobie lors d’exercices de haute intensité1. À mesure que la durée de l’exercice augmente, l’oxydation du glucose et des acides gras contribue davantage à la production globale d’énergie2. Cependant, l’utilisation du substrat ne dépend pas seulement de la disponibilité, car les substrats rivalisent de manière antagoniste lors de l’oxydation. Plus particulièrement, il a été démontré que l’oxydation des acides gras inhibe l’utilisation du glucose par le muscle squelettique dans un phénomène connu sous le nom d’effet Randle3. Un effet réciproque a été démontré par des études ultérieures 4,5. En outre, de nombreuses maladies sont associées à un changement de préférence de substrat et au développement d’une rigidité métabolique dans les cellules. Par exemple, l’oxydation des acides gras est réduite dans le muscle squelettique des patients diabétiques de type II par rapport aux sujets témoins normaux6. Les changements métaboliques dans les contextes de la maladie font l’objet d’une enquête intense car ils peuvent contribuer à la pathogenèse.
Le métabolisme énergétique dans les types de cellules squelettiques est relativement peu étudié, mais a attiré l’attention ces dernières années7. Des travaux antérieurs ont montré que la glycolyse aérobie est la voie énergétique dominante dans les ostéoblastes calvariaires, tandis que l’oxydation du glucose par le cycle TCA joue un rôle dans la formation d’ostéoclastes 8,9. D’autres ont fourni des preuves que les acides gras étaient une source d’énergie pour les ostéoblastes10. Il a également été démontré que le catabolisme de la glutamine favorise la différenciation des ostéoblastes par rapport aux progéniteurs11,12. Cependant, une compréhension globale de l’utilisation du substrat par divers types de cellules squelettiques fait encore défaut. En outre, les changements dans le métabolisme cellulaire au cours de la différenciation cellulaire ou en réponse à des signaux pathologiques devraient modifier l’utilisation du substrat de carburant. Décrit ci-dessous est un protocole facile à utiliser pour tester l’oxydation du substrat in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

Les mitochondries hébergent la machinerie du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et de la chaîne de transport d’électrons (ETC), qui génèrent de l’adénosine triphosphate (ATP) pour maintenir l’homéostasie énergétique. Le glucose, les acides gras et les acides aminés sont les principaux substrats énergétiques alimentant la respiration mitochondriale dans la plupart des cellules somatiques. Les preuves montrent que différents types de cellules peuvent avoir une préférence distincte pour certains substrats. Cependant, l’utilisation du substrat par diverses cellules du squelette n’a pas été étudiée en détail. De plus, comme le métabolisme cellulaire est adapté aux changements physiologiques et physiopathologiques, des évaluations directes de la dépendance au substrat dans les cellules squelettiques peuvent fournir des informations importantes sur la pathogenèse des maladies osseuses.
Le protocole suivant est basé sur le principe de la libération de dioxyde de carbone par les molécules de substrat après phosphorylation oxydative. En utilisant des substrats contenant des atomes de carbone marqués radioactivement (14C), la méthode fournit un test sensible et facile à utiliser pour le taux d’oxydation du substrat en culture cellulaire. Une étude de cas avec des préostéoblastes calvariaires primaires par rapport à des macrophages dérivés de la moelle osseuse (MGM) démontre une utilisation différente des principaux substrats entre les deux types de cellules.

Dans cet exemple, la méthode de piégeage du CO2 est utilisée pour comparer l’oxydation du substrat par les préostéoblastes calvariaires primaires par rapport aux MBM, qui sont fréquemment utilisés pour la différenciation in vitro des ostéoblastes ou des ostéoclastes, respectivement. Une fois que les cellules primaires sont passées et cultivées dans cMEMα pendant la nuit, elles atteignent généralement 80 à 90% de la confluence et présentent leur morphologie caractéristique. Les pré...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Ce protocole décrit une méthode facile à utiliser pour examiner l’oxydation du substrat en suivant la production de 14CO2 in vitro.

Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14CO2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

L’utilisation de différents substrats énergétiques est à la fois spécifique au type de cellule et indicative de la maladie. La mesure de la consommation des substrats spécifiques peut éclairer à la fois la biologie normale et la pathologie. La technique ne nécessite pas d’équipement spécialisé et est facile à mettre à l’échelle.Il est également plus facile à utiliser que les méthodes publiées précédemment. Comprendre les changements dans le taux d’oxydation du substrat permettra le développement d’interventions diététiques et pharmacologiques pour les troubles métaboliques. Bien que démontrée avec du tissu osseux, cette technique est facilement personnalisée pour étudier la flexibilité métabolique dans tous les types de cellules, ce qui permet de comprendre à la fois les causes et les conséquences des changements métaboliques.Après avoir sacrifié les chiots de trois à cinq jours postnatals, transférez-les dans une solution antibiotique double de D PBS glacé contenant de la pénicilline streptomycine. Exposez le calvaire en enlevant la peau et les tissus mous. Collectez la région centrale en coupant les tissus environnants de l’arrière vers l’avant dans D PBS.Grattez doucement les surfaces interne et externe de la calvarie à l’aide d’une pince à épiler pour aider à libérer les cellules lors de la digestion ultérieure. Préparer 2 et 4 milligrammes par millilitre de solutions de collagénase de type deux dans D PBS et filtrer chaque solution avec un filtre frais de 0,22 micromètre. Tout d’abord, digérez la calvaire nettoyée avec deux milligrammes par millilitre de solution de collagénase pendant 15 minutes, puis jetez la solution de digestion.Ensuite, digérez les échantillons propres dans quatre milligrammes par millilitre de solution de collagénase trois fois pendant 15 minutes à chaque fois. Ensuite, tirez la solution de digestion et enregistrez-la. Filtrer la solution de digestion à travers des tamis cellulaires de 70 micromètres et centrifuger le filtrat à 300 RCF pendant cinq minutes.Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu alpha MEM complet contenant 10% de FBS et une solution antibiotique double de streptomycine de pénicilline. Comptez et ensemencez les cellules dans une plaque de 10 centimètres. Cultivez les cellules dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours.Ensuite, dissociez les cellules à 37 degrés Celsius avec 0,25 trypsine EDTA. Après la digestion, comptez et ensemencez les cellules dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits avec un milieu alpha MEM complet contenant 10% de FBS et une solution antibiotique double de streptomycine de pénicilline. Ensemencez au moins quatre puits par type de cellule et par substrat, et au moins trois puits supplémentaires pour chaque type de cellule pour le comptage préalable au dosage.Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir retiré le muscle et le tissu conjonctif de souris âgées de huit semaines et recueilli les fémurs et les tibias, coupez et jetez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants. Débusquez la moelle osseuse d’un fémur et d’un tibia dans une boîte de Petri fraîche de 10 centimètres avec une seringue équipée d’une aiguille de calibre 23 contenant 15 millilitres de milieu alpha MEM complet avec une solution antibiotique double de streptomycine à 10% de pénicilline FBS et un milieu conditionné à 10% CGM 14 12.Cultivez les cellules dans la boîte de Pétri dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après trois jours, jetez le milieu de culture et rincez les cellules avec du D PBS. Dissocier les cellules attachées à 37 degrés Celsius avec 0,25% de trypsine EDTA pendant cinq minutes.Après centrifugation, remettez en suspension la pastille cellulaire dans le milieu BMM. Compter et ensemencer les cellules dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits selon la procédure décrite précédemment. Culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans le milieu BMM avant de commencer les essais.Lavez les cellules dans les puits supplémentaires deux fois avec D PBS. Dissocier les cellules avec 0,25% de trypsine EDTA. Suspendre 20 microlitres de cellules digérées dans D PBS.Avec 20 microlitres de solution de colorant à l’orange acridine et à l’iodure de propidium, déterminez le nombre de cellules vivantes avec un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre. Lavez les cellules dans les puits d’essai deux fois avec D PBS. Ajoutez 500 microlitres de milieu chaud à chaque puits d’essai dans la hotte de culture tissulaire désignée RAM.Après avoir scellé la plaque avec un parafilm, incuber les cellules dans un incubateur désigné RAM à 37 degrés Celsius pendant 4 heures. Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires, légèrement plus grands que la zone à l’intérieur du capuchon du tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et insérez le papier bien dans le capuchon. Ajouter 200 microlitres d’un acide perchlorique 1 molaire à chaque tube et 20 microlitres d’hydroxyde de sodium au papier filtre inséré à l’intérieur du bouchon.Après l’incubation des cellules, transférez 400 microlitres de milieu de culture de chaque puits vers les tubes préparés et fermez immédiatement les bouchons. Laissez les tubes dans un porte-tubes à température ambiante pendant une heure. Pendant l’incubation, Parallelae a mis en place un flacon de scintillation pour chaque tube et l’a rempli de quatre millilitres de liquide de scintillation.Transférer chaque morceau de papier filtre dans un flacon de scintillation et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Effectuez des tests d’essuyage sur la hotte de culture tissulaire, le bain-marie, le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour détecter toute contamination potentielle par la RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons de scintillation contenant du liquide de scintillation.Mesurez l’activité radio du carbone 14 dans les flacons de scintillation à l’aide d’un compteur de scintillation et enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail, selon les directives de radioprotection, si nécessaire. La figure compare l’oxydation du substrat par les pré-ostéoblastes de calvarie primaire par rapport aux MGM.Une fois que les cellules primaires sont passées et cultivées dans un milieu alpha MEM complet pendant la nuit, elles atteignent généralement 80 à 90% de confluence et présentent leur morphologie caractéristique. Les pré-ostéoblastes calvariaires sont nettement plus grands que les MMC. Les résultats de l’oxydation du substrat ont montré que le taux d’oxydation de chaque substrat est significativement plus élevé dans les pré-ostéoblastes calvariaires que dans les MGM, ce qui indique probablement une production d’énergie plus élevée par phosphorylation oxydative dans les pré-ostéoblastes.Le troisième papier inséré doit être légèrement plus grand qu’un capuchon supérieur de tube ebin de 1,7 millilitre. Cette méthode peut être utilisée en conjonction avec la consommation d’oxygène et pour déterminer le taux global de phosphorylation oxydative et de production lactative dans les cellules. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer l’utilisation du substrat au cours de stades de différenciation distincts ou de contextes pathologiques.Avec ces connaissances, nous pouvons développer des interventions pour les troubles métaboliques.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Recherche

Biologie

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Surveillance en temps réel des interactions ligand-récepteur avec Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Détermination de oxydation des acides gras et de la lipogenèse dans les hépatocytes primaires de souris

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Évaluation de la disponibilité des minéraux dans les aliments pour poissons à l’aide de méthodes complémentaires démontrées par l’exemple du zinc dans le saumon de l’Atlantique

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Évaluation des interactions protéiques dans les cellules vivantes avec émission sensibilisée au FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Détermination de la dépense énergétique basale et de la capacité des adipocytes thermogéniques à dépenser de l’énergie chez les souris obèses

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Application du mouvement passif de la tête pour générer des accélérations définies à la tête des rongeurs

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...