Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

העבודה נתמכה בחלקה על ידי מענק NIH R01 AR060456 (FL). אנו מודים לד"ר מייקל רובינסון ואליזבת קריזמן (בית החולים לילדים של פילדלפיה) על עזרתם הנדיבה במונה ההברקה.

השימוש בחומרים רדיואקטיביים (RAM) דורש אישור מראש של ועדת בטיחות ייעודית בכל מוסד. RAMs המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי בריאות ובטיחות קרינה סביבתית (EHRS) באוניברסיטת פנסילבניה. השימוש בבעלי חיים דורש אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במוסד הביתי. המחקר הבא אושר על יד...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus.">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li><li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids,+ketone+bodies+and+pyruvate,+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation,+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles.">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists.">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li><li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+osteoblast:+implications+for+osteoporosis.">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation.">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li><li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

הפרוטוקול מספק שיטה קלה לשימוש לקביעת קצב החמצון של מצעי אנרגיה עיקריים. זוהי חלופה פשוטה יותר לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בצלוחיות המכילות באר מרכזית ומכוסות בפקקי גומי 14,15,16. למרות שהמחקר לדוגמה כאן מבוצע עם תרבית תאים, ניתן להתאים את ה?...

זרחון חמצוני (OXPHOS) באאוקריוטים הוא התהליך שבו חומרי מזון מתפרקים בתוך המיטוכונדריה כדי לשחרר אנרגיה כימית בצורה של ATP באמצעות צריכת חמצן.  קטבוליזם של מצעים שונים בתוך המיטוכונדריה באמצעות מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) מייצר מעט מולקולות ATP ישירות, אלא מאחסן אנרגיה באמצעות הפחתה של נושאי האלקטרונים ניקוטיןמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD+) ופלווין אדנין דינוקלאוטיד (FAD+). לאחר מכן הנשאים המופחתים מתחמצנים על ידי ETC הממוקם על הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה כדי ליצור שיפוע ריכוז פרוטונים על פני הממברנה. הפרוטונים זורמים בסופו של דבר במורד השיפוע שלהם בחזרה לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית דרך ATP synthase כדי לייצר ATP. OXPHOS הוא האמצעי היעיל ביותר לייצור ATP מצעי אנרגיה ומועדף בדרך כלל בסביבות אירוביות. בעבר, גליקוליזה אירובית - ייצור של לקטט מגלוקוז בזמן שיש חמצן - נחשבה לפתופיזיולוגית, לעתים קרובות סימן היכר של תאים סרטניים. יותר ויותר, מתגלה כי כמה סוגי תאים נורמליים משתמשים בגליקוליזה אירובית מסיבות שעדיין לא פוענחו במלואן.
גמישות מטבולית היא היכולת של תאים או אורגניזמים להסתגל לדרישות האנרגיה המשתנות ולמקורות הדלק הזמינים. לדוגמה, הביקוש האנרגטי של שרירי השלד נענה בעיקר על ידי OXPHOS במצב יציב אך על ידי גליקוליזה אנאירובית במהלך תרגיל בעצימות גבוהה1. ככל שמשך הפעילות הגופנית גדל, חמצון הגלוקוז וחומצות השומן תורמים יותר לייצור האנרגיה הכולל2. עם זאת, השימוש במצע אינו תלוי רק בזמינות, שכן מצעים מתחרים באופן אנטגוניסטי במהלך חמצון. בעיקר, חמצון חומצות שומן הוכח כמעכב את ניצול הגלוקוז על ידי שרירי השלד בתופעה הידועה בשם אפקט רנדל3. השפעה הדדית הודגמה על ידי מחקרים מאוחרים יותר 4,5. בנוסף, מחלות רבות קשורות לשינוי בהעדפת המצע ולהתפתחות של חוסר גמישות מטבולית בתאים. לדוגמה, חמצון חומצות שומן מופחת בשריר השלד של חולי סוכרת מסוג II בהשוואה לנבדקי ביקורת רגילים6. השינויים המטבוליים בהגדרות המחלה הם נושא לחקירה אינטנסיבית מכיוון שהם עשויים לתרום לפתוגנזה.
חילוף החומרים האנרגטי בסוגי תאי השלד הוא יחסית לא מובן מאליו, אך זכה לתשומת לב בשנים האחרונות7. עבודות קודמות הראו כי גליקוליזה אירובית היא מסלול האנרגיה הדומיננטי באוסטאובלסטים קלבריאליים, בעוד שחמצון גלוקוז באמצעות מחזור TCA ממלא תפקיד בהיווצרות אוסטאוקלסט 8,9. אחרים סיפקו ראיות לחומצות שומן כמקור אנרגיה לאוסטאובלסטים10. כמו כן, הוכח כי קטבוליזם של גלוטמין תומך בהתמיינות אוסטאובלסט מאבותאבותיהם 11,12. עם זאת, עדיין חסרה הבנה מקיפה של שימוש במצע על ידי סוגי תאי שלד שונים. בנוסף, שינויים בחילוף החומרים התאי במהלך התמיינות תאים או בתגובה לאותות פתולוגיים צפויים לשנות את ניצול מצע הדלק. להלן פרוטוקול קל לשימוש לבדיקת חמצון מצע במבחנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

המיטוכונדריה מארחת את המכונות למחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) ולשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), המייצרות אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי לשמור על הומאוסטזיס של אנרגיה. גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו הם מצעי האנרגיה העיקריים המניעים את הנשימה המיטוכונדרית ברוב התאים הסומאטיים. עדויות מראות שלסוגי תאים שונים עשויה להיות העדפה מובהקת למצעים מסוימים. עם זאת, ניצול המצע על ידי תאים שונים בשלד לא נחקר בפירוט. יתר על כן, מכיוון שמטבוליזם תאי מכוון לשינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, הערכות ישירות של תלות במצע בתאי השלד עשויות לספק תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות עצם.
הפרוטוקול הבא מבוסס על העיקרון של שחרור פחמן דו חמצני ממולקולות מצע לאחר זרחון חמצוני. על ידי שימוש במצעים המכילים אטומי פחמן המסומנים באופן רדיואקטיבי (14C), השיטה מספקת בדיקה רגישה וקלה לשימוש לקצב חמצון המצע בתרבית תאים. מקרה בוחן עם פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) מדגים ניצול שונה של המצעים העיקריים בין שני סוגי התאים.

בדוגמה זו, שיטת לכידת CO2 משמשת להשוואת חמצון המצע על ידי פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת BMMs, המשמשים לעתים קרובות עבור אוסטאובלסט במבחנה או התמיינות אוסטאוקלסט או אוסטאוקלסט, בהתאמה. לאחר שהתאים הראשוניים מועברים ומתרבית ב-cMEMα במהלך הלילה, הם בדרך כלל מגיעים ל-80-90% מהמפגש ומציגים ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לשימוש לבחינת חמצון מצע על ידי מעקב אחר ייצור 14CO2 במבחנה.

הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת CO 2 14

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

השימוש במצעי אנרגיה שונים הוא גם ספציפי לסוג התא וגם מעיד על מחלה. מדידת הצריכה של המצעים הספציפיים יכולה לשפוך אור הן על הביולוגיה הרגילה והן על הפתולוגיה. הטכניקה אינה זקוקה לציוד מיוחד וקלה להרחבה.הוא גם קל יותר לשימוש מאשר שיטות קודמות שפורסמו. הבנת השינויים בקצב חמצון המצע תאפשר התפתחות של התערבויות תזונתיות ופרמקולוגיות להפרעות מטבוליות. למרות שהיא מודגמת עם רקמת עצם טכניקה זו מותאמת אישית בקלות כדי לחקור גמישות מטבולית בכל סוגי התאים ומספקת הבנה הן של הגורמים והן של ההשלכות של שינויים מטבוליים.לאחר הקרבת הגורים במשך שלושה עד חמישה ימים לאחר הלידה, העבירו אותם ל-D PBS קר כקרח המכיל תמיסת אנטיביוטיקה כפולה לפניצילין סטרפטומיצין. חשוף את הקלבריה על ידי הסרת העור והרקמות הרכות. אסוף את האזור האמצעי על ידי חיתוך הרקמות הסובבות מאחור לחזית ב- D PBS.מגרדים את המשטחים הפנימיים והחיצוניים של הקלבריה בעדינות באמצעות פינצטה כדי לסייע בשחרור התאים בעת העיכול הבא. מכינים 2 ו-4 מיליגרם לתמיסות מיליליטר של קולגן מסוג 2 ב-D PBS ומסננים כל תמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר טרי. ראשית, לעכל את הקלבריה המנוקה עם שני מיליגרם לכל מיליליטר קולגן תמיסה במשך 15 דקות, ולאחר מכן להשליך את תמיסת העיכול.לאחר מכן, לעכל את הדגימות הנקיות בארבעה מיליגרם לכל מיליליטר קולגן תמיסה שלוש פעמים במשך 15 דקות בכל פעם. לאחר מכן, משכו את תמיסת העיכול ושמרו אותה. סנן את תמיסת העיכול דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר וצנטריפוגה של הסכלאט ב-300 RCF למשך חמש דקות.להשעות מחדש את גלולת התא במדיום אלפא MEM מלא המכיל 10%FBS ופניצילין סטרפטומיצין תמיסה אנטיביוטית כפולה. לספור ולזרוע את התאים בצלחת של 10 סנטימטרים. תרבית את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני במשך שלושה ימים.לאחר מכן, נתקו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 0.25 טריפסין EDTA. לאחר העיכול, ספרו וזרעו את התאים בצלחת תרבית תאים של 24 היטב עם מדיום אלפא MEM שלם המכיל 10%FBS ופניצילין סטרפטומיצין תמיסה אנטיביוטית כפולה. זרעו לפחות ארבע בארות לכל סוג תא לכל מצע, ולפחות שלוש בארות נוספות לכל סוג תא לספירה לפני הבדיקה.תרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה. לאחר הסרת השריר ורקמת החיבור מעכברים בני שמונה שבועות ואיסוף עצם הירך והטיביות, חותכים ומשליכים את שני קצות העצמות במספריים חדים. שטפו את מח העצם מעצם הירך מעצם הירך וטיביה אחת לתוך צלחת פטרי טרייה בקוטר 10 ס"מ עם מזרק המצויד במחט 23 מדים המכילה 15 מיליליטרים של מדיום אלפא MEM שלם עם תמיסת אנטיביוטיקה כפולה של 10% פניצילין סטרפטומיצין, ו-10% CGM 14 12 בינוני מותנה.תרבית את התאים בצלחת פטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שלושה ימים משליכים את מדיית התרבית ושוטפים את התאים ב-D PBS. נתקו את התאים המחוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין EDTA למשך חמש דקות.לאחר צנטריפוגה, להשעות מחדש את גלולת התא בתווך BMM. לספור ולזרוע את התאים בצלחת תרבית תאים של 24 באר לפי ההליך שתואר קודם לכן. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס לילה במדיום BMM לפני תחילת המבחנים.שטפו את התאים בבארות הנוספות פעמיים עם D PBS. נתקו את התאים עם 0.25% טריפסין EDTA. להשעות מחדש 20 מיקרוליטרים של תאים מעוכלים ב- D PBS.עם 20 מיקרוליטרים של תמיסת צבע כתום אקרידין ופרופידיום יודיד, קבעו את מספר התאים החיים עם מונה תאים אוטומטי ותעדו את המספר. לשטוף את התאים בבארות הבדיקה פעמיים עם D PBS. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום חם לכל בדיקה היטב במכסה המנוע המיועד לתרביות רקמה המיועדות ל-RAM.לאחר איטום הצלחת עם parafilm, דגירה של התאים באינקובטור המיועד RAM ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. במהלך הדגירה, חותכים נייר מסנן לחתיכות עגולות, מעט גדולות יותר מהשטח שבתוך המכסה של צינור המיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ומכניסים את הנייר בנוחות לתוך הכובע. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חומצה פרכלורית טוחנת אחת לכל צינור ו-20 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד לנייר הסינון המותקן בתוך הפקק.לאחר דגירה של התאים, מעבירים 400 מיקרוליטרים של מדיום תרבית מכל באר לצינורות המוכנים וסוגרים את הפקקים באופן מיידי. השאירו את הצינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה. מקבילים במהלך הדגירה הקימו בקבוקון סקינטילציה לכל צינור וממלאים אותו בארבעה מיליליטרים של נוזל נצנוץ.מעבירים כל פיסת נייר מסנן לבקבוקון חרטום ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בצע בדיקות מגבונים על מכסה המנוע של תרבית הרקמה, על אמבט המים, על המקרר, על האינקובטור, על הכיור, על הקרקע ועל כל אזור עבודה אחר לאיתור זיהום פוטנציאלי של זיכרון RAM. מכניסים את מגבוני הנייר לבקבוקוני סקינטילציה המכילים נוזל סקינטילציה.מדוד את פעילות הרדיו של פחמן 14 בבקבוקוני ה-scintillation באמצעות מונה נצנוץ ותעד את תוצאות הקריאה. נטרל את סביבת העבודה, על פי הנחיות בטיחות הקרינה, במידת הצורך. האיור משווה חמצון מצע על ידי קלבריה ראשונית קדם-אוסטאובלסטים לעומת BMMs.לאחר שהתאים הראשוניים מועברים ומתורגבים בתרבית במדיום אלפא MEM שלם בן לילה, הם בדרך כלל מגיעים למפגש של 80 עד 90% ומציגים את המורפולוגיה האופיינית להם. הקדם-אוסטאובלסטים הקלבריאליים גדולים משמעותית מ-BMMs. התוצאות של חמצון המצע הראו כי קצב החמצון של כל מצע גבוה משמעותית בפרה-אוסטאובלסטים של קלבריה מאשר ב-BMMs, מה שככל הנראה מצביע על ייצור אנרגיה גבוה יותר על ידי זרחון חמצוני בפרה-אוסטאובלסטים.הנייר השלישי שהוכנס צריך להיות מעט גדול יותר ממכסה צינור עליון של 1.7 מיליליטר. ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם צריכת חמצן ולקבוע את הקצב הכולל של זרחון חמצוני וייצור הנקה בתאים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לקבוע את השימוש במצע במהלך שלבי הבחנה שונים או הגדרות מחלה.עם הידע הזה אנחנו יכולים לפתח התערבויות עבור הפרעות מטבוליות.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

הערכת זמינות המינרלים בהזנות דגים בשיטות משלימות המודגמת עם הדוגמה של אבץ בסלמון אטלנטי

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

מדידת שטף מצע מיטוכונדריאלי בתאים פרומינגוליסין O-פרמיבילים

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

קביעת ההוצאה על אנרגיה בזלית והקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוצאות אנרגיה בעכברים שמנים

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

יישום של תנועת ראש פסיבית ליצירת תאוצות מוגדרות בראשי מכרסמים

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...