Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
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Il lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione NIH R01 AR060456 (FL). Ringraziamo il Dr. Michael Robinson ed Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) per il loro generoso aiuto con il contatore di scintillazione.

L'uso di materiali radioattivi (RAM) richiede l'approvazione preventiva di un comitato di sicurezza designato presso ciascuna istituzione. Le RAM utilizzate in questo protocollo sono state approvate da Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) presso l'Università della Pennsylvania. L'uso di animali richiede l'approvazione preventiva da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'istituzione di origine. Il seguente studio è stato approvato dalla IACUC presso il Children's Ho...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. 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Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. 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C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

Il protocollo fornisce un metodo facile da usare per determinare il tasso di ossidazione dei principali substrati energetici. È un'alternativa più semplice ad altri protocolli che utilizzano palloni contenenti un pozzo centrale e ricoperti da tappi di gomma 14,15,16. Sebbene lo studio di esempio qui sia eseguito con coltura cellulare, il metodo può essere facilmente adattato per espianti tissutali o omogeneizzati tissutali co...

La fosforilazione ossidativa (OXPHOS) negli eucarioti è il processo attraverso il quale i nutrienti vengono scomposti all'interno dei mitocondri per rilasciare energia chimica sotto forma di ATP attraverso il consumo di ossigeno.  Il catabolismo di vari substrati all'interno dei mitocondri attraverso il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) genera direttamente poche molecole di ATP, ma piuttosto immagazzina energia attraverso la riduzione dei portatori di elettroni nicotinamide adenina dinucleotide (NAD +) e flavina adenina dinucleotide (FAD +). I portatori ridotti vengono quindi ossidati da ETC situati sulla membrana interna dei mitocondri per generare un gradiente di concentrazione protonica attraverso la membrana. I protoni alla fine fluiscono lungo il loro gradiente nella matrice mitocondriale attraverso l'ATP sintasi per produrre ATP. OXPHOS è il mezzo più efficiente di produzione di ATP da substrati energetici e generalmente preferito in ambienti aerobici. In precedenza, la glicolisi aerobica - produzione di lattato dal glucosio mentre l'ossigeno è presente - era ritenuta fisiopatologica, spesso un segno distintivo delle cellule tumorali. Sempre di più, si sta scoprendo che alcuni tipi di cellule normali usano la glicolisi aerobica per ragioni che devono ancora essere completamente decifrate.
La flessibilità metabolica è la capacità delle cellule o degli organismi di adattarsi alle mutevoli richieste di energia e alle fonti di combustibile disponibili. Ad esempio, la domanda energetica del muscolo scheletrico è soddisfatta principalmente da OXPHOS allo stato stazionario, ma dalla glicolisi anaerobica durante l'esercizio ad alta intensità1. Con l'aumentare della durata dell'esercizio, l'ossidazione del glucosio e degli acidi grassi contribuisce maggiormente alla produzione complessiva di energia2. Tuttavia, l'uso del substrato non dipende solo dalla disponibilità, poiché i substrati competono antagonisticamente durante l'ossidazione. In particolare, l'ossidazione degli acidi grassi ha dimostrato di inibire l'utilizzo del glucosio da parte del muscolo scheletrico in un fenomeno noto come effetto Randle3. Un effetto reciproco è stato dimostrato da studi successivi 4,5. Inoltre, molte malattie sono associate a un cambiamento nella preferenza del substrato e allo sviluppo di inflessibilità metabolica nelle cellule. Ad esempio, l'ossidazione degli acidi grassi è ridotta nel muscolo scheletrico dei pazienti diabetici di tipo II rispetto ai normali soggetti di controllo6. I cambiamenti metabolici nelle impostazioni della malattia sono oggetto di intense indagini in quanto possono contribuire alla patogenesi.
Il metabolismo energetico nei tipi di cellule scheletriche è relativamente poco studiato, ma ha attirato l'attenzione negli ultimi anni7. Lavori precedenti hanno dimostrato che la glicolisi aerobica è la via energetica dominante negli osteoblasti calvariali, mentre l'ossidazione del glucosio attraverso il ciclo TCA svolge un ruolo nella formazione degli osteoclasti 8,9. Altri hanno fornito prove per gli acidi grassi come fonte di energia per gli osteoblasti10. Il catabolismo della glutammina ha anche dimostrato di supportare la differenziazione degli osteoblasti dai progenitori11,12. Tuttavia, manca ancora una comprensione completa dell'utilizzo del substrato da parte di vari tipi di cellule scheletriche. Inoltre, si prevede che i cambiamenti nel metabolismo cellulare durante la differenziazione cellulare o in risposta a segnali patologici alterino l'utilizzo del substrato del carburante. Di seguito è descritto un protocollo di facile utilizzo per l'analisi dell'ossidazione del substrato in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

I mitocondri ospitano i macchinari per il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e la catena di trasporto degli elettroni (ETC), che generano adenosina trifosfato (ATP) per mantenere l'omeostasi energetica. Glucosio, acidi grassi e amminoacidi sono i principali substrati energetici che alimentano la respirazione mitocondriale nella maggior parte delle cellule somatiche. L'evidenza mostra che diversi tipi di cellule possono avere una netta preferenza per determinati substrati. Tuttavia, l'utilizzo del substrato da parte di varie cellule nello scheletro non è stato studiato in dettaglio. Inoltre, poiché il metabolismo cellulare è in sintonia con i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici, le valutazioni dirette della dipendenza dal substrato nelle cellule scheletriche possono fornire importanti informazioni sulla patogenesi delle malattie ossee.
Il seguente protocollo si basa sul principio del rilascio di anidride carbonica dalle molecole del substrato dopo fosforilazione ossidativa. Utilizzando substrati contenenti atomi di carbonio marcati radioattivamente (14C), il metodo fornisce un saggio sensibile e facile da usare per il tasso di ossidazione del substrato in coltura cellulare. Un caso di studio con preosteoblasti calvariali primari rispetto a macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) dimostra un diverso utilizzo dei substrati principali tra i due tipi di cellule.

In questo esempio, il metodo di intrappolamento della CO2 viene utilizzato per confrontare l'ossidazione del substrato da parte dei preosteoblasti calvariali primari rispetto ai BMM, che vengono spesso utilizzati rispettivamente per la differenziazione in vitro degli osteoblasti o degli osteoclasti. Dopo che le cellule primarie sono passate e coltivate in cMEMα durante la notte, in genere raggiungono l'80-90% della confluenza e mostrano la loro morfologia caratteristica. I preosteoblasti calvariali s...

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Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Questo protocollo descrive un metodo facile da usare per esaminare l'ossidazione del substrato monitorando la produzione di 14CO2 in vitro.

Valutazione dell'ossidazione del substrato energetico in vitro con 14INtrappolamento di CO 2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

L'uso di diversi substrati energetici è sia specifico del tipo cellulare che indicativo della malattia. Misurare il consumo dei substrati specifici può far luce sia sulla normale biologia che sulla patologia. La tecnica non ha bisogno di attrezzature specializzate ed è facile da scalare.È anche più facile da usare rispetto ai metodi pubblicati in precedenza. Comprendere i cambiamenti nel tasso di ossidazione del substrato consentirà lo sviluppo di interventi dietetici e farmacologici per i disturbi metabolici. Sebbene dimostrata con il tessuto osseo, questa tecnica è facilmente personalizzabile per studiare la flessibilità metabolica in tutti i tipi di cellule fornendo una comprensione sia delle cause che delle conseguenze dei cambiamenti metabolici.Dopo aver sacrificato i cuccioli da tre a cinque giorni postnatali, trasferirli in D PBS ghiacciato contenente penicillina streptomicina doppia soluzione antibiotica. Esporre la calvaria rimuovendo la pelle e i tessuti molli. Raccogliere la regione centrale tagliando i tessuti circostanti da dietro a davanti in D PBS.Gratta delicatamente le superfici interne ed esterne della calvaria usando una pinzetta per aiutare a rilasciare le cellule dopo la successiva digestione. Preparare soluzioni da 2 e 4 milligrammi per millilitro di collagenasi di tipo due in D PBS e filtrare ogni soluzione con un filtro micrometro fresco da 0,22. In primo luogo, digerire la calvaria pulita con due milligrammi per millilitro di soluzione di collagenasi per 15 minuti, quindi scartare la soluzione di digestione.Quindi, digerire i campioni puliti in quattro milligrammi per millilitro di soluzione di collagenasi tre volte per 15 minuti ogni volta. Quindi, tirare la soluzione di digestione e salvarla. Filtrare la soluzione di digestione attraverso filtri a celle da 70 micrometri e centrifugare il filtrato a 300 RCF per cinque minuti.Sospendere il pellet cellulare in mezzo mem alfa completo contenente il 10% di FBS e penicillina streptomicina doppia soluzione antibiotica. Conta e semina le cellule in un piatto di 10 centimetri. Coltiva le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre giorni.Quindi, dissociare le cellule a 37 gradi Celsius con 0,25 tripsina EDTA. Dopo la digestione, contare e seminare le cellule in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti con un mezzo meM alfa completo contenente il 10% di FBS e la penicillina streptomicina doppia soluzione antibiotica. Seminare almeno quattro pozzetti per tipo di cellula per substrato e almeno tre pozzetti extra per ogni tipo di cellula per il conteggio pre-saggio.Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver rimosso il muscolo e il tessuto connettivo da topi di otto settimane e raccolto femori e tibie, tagliare e scartare entrambe le estremità delle ossa con forbici affilate. Sciacquare il midollo osseo da un femore e una tibia in una capsula di Petri fresca di 10 centimetri con una siringa dotata di un ago calibro 23 contenente 15 millilitri di mezzo meM alfa completo con soluzione antibiotica doppia di penicillina streptomicina al 10% FBS e 10% CGM 14 12 mezzo condizionato.Coltiva le cellule nella capsula di Petri in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo tre giorni scartare il terreno di coltura e risciacquare le cellule con D PBS. Dissociare le cellule attaccate a 37 gradi Celsius con 0,25% di tripsina EDTA per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, sospendere nuovamente il pellet di cella nel mezzo BMM. Contare e seminare le cellule in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti secondo la procedura descritta in precedenza. Coltura a 37 gradi Celsius durante la notte nel mezzo BMM prima di iniziare i test.Lavare le cellule nei pozzetti extra due volte con D PBS. Dissociare le cellule con 0,25% tripsina EDTA. Sospendere 20 microlitri di cellule digerite in D PBS.Con 20 microlitri di soluzione di colorante acridina arancio e ioduro di propidio, determinare il numero di cellule vive con un contatore cellulare automatizzato e registrare il numero. Lavare le cellule nei pozzetti di analisi due volte con D PBS. Aggiungere 500 microlitri di mezzo caldo a ciascun test bene nella cappa di coltura tissutale designata ram.Dopo aver sigillato la piastra con parafilm, incubare le cellule in un incubatore designato RAM a 37 gradi Celsius per 4 ore. Durante l'incubazione, tagliare la carta da filtro in pezzi circolari, leggermente più grandi dell'area all'interno del tappo del tubo della microcentrifuga da 1,5 millilitri e inserire la carta comodamente nel tappo. Aggiungere 200 microlitri di un acido perclorico molare 1 a ciascun tubo e 20 microlitri di idrossido di sodio alla carta da filtro montata all'interno del tappo.Dopo aver incubato le cellule, trasferire 400 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzo ai tubi preparati e chiudere immediatamente i tappi. Lasciare i tubi in un portatubi a temperatura ambiente per un'ora. Parallelae durante l'incubazione predispone una fiala di scintillazione per ogni tubo e la riempie con quattro millilitri di fluido di scintillazione.Trasferire ogni pezzo di carta da filtro in un flaconcino scintillante e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Eseguire test di pulizia sulla cappa di coltura del tessuto, sul bagno d'acqua, sul frigorifero, sull'incubatore, sul lavandino, sul terreno e su qualsiasi altra area di lavoro per una potenziale contaminazione da RAM. Mettere le salviette di carta in flaconcini di scintillazione contenenti liquido di scintillazione.Misurare l'attività radio del carbonio 14 nelle fiale di scintillazione con un contatore di scintillazione e registrare i risultati di lettura. Decontaminare l'ambiente di lavoro, secondo le linee guida sulla sicurezza delle radiazioni, se necessario. La figura confronta l'ossidazione del substrato da parte di pre osteoblasti primari di calvaria rispetto ai BMM.Dopo che le cellule primarie sono passate e coltivate in mezzo MEM alfa completo durante la notte, in genere raggiungono l'80-90% di confluenza e mostrano la loro morfologia caratteristica. I pre osteoblasti calvariali sono notevolmente più grandi dei BBM. I risultati dell'ossidazione del substrato hanno mostrato che il tasso di ossidazione per ciascun substrato è significativamente più alto nei pre osteoblasti calvariali rispetto ai BBM, probabilmente indicando una maggiore produzione di energia per fosforilazione ossidativa nei pre osteoblasti.La terza carta inserita deve essere leggermente più grande di un tappo del tubo superiore da 1,7 millilitri. Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con il consumo di ossigeno e per determinare il tasso complessivo di fosforilazione ossidativa e produzione lattativa nelle cellule. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare l'utilizzo del substrato durante fasi di differenziazione distinte o impostazioni della malattia.Con questa conoscenza possiamo sviluppare interventi per i disturbi metabolici.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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