Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
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この作業は、NIH助成金R01 AR060456(FL)によって部分的に支援されました。マイケル・ロビンソン博士とエリザベス・クリズマン博士(フィラデルフィア小児病院)がシンチレーションカウンターを惜しみなく助けてくれたことに感謝します。

放射性物質(RAM)の使用には、各機関の指定安全委員会による事前の承認が必要です。このプロトコルで使用されるRAMは、ペンシルベニア大学のEnvironmental Health & Radiation Safety(EHRS)によって承認されています。動物の使用には、在宅施設の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)による事前の承認が必要です。以下の研究は、フィラデルフィア小児病院でIACUCによって承認された。
<p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus.">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li><li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids,+ketone+bodies+and+pyruvate,+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation,+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles.">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists.">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li><li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+osteoblast:+implications+for+osteoporosis.">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation.">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li><li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

このプロトコルは、主要なエネルギー基板の酸化速度を決定するための使いやすい方法を提供します。これは、中央ウェルを含むフラスコを使用し、ゴム栓14、15、16で蓋をする他のプロトコルに代わるより簡単な代替手段である。ここでの実施例研究は細胞培養を用いて行われるが、この方法は、先に説明したように、無...

真核生物における酸化的リン酸化(OXPHOS)は、栄養素がミトコンドリア内で分解され、酸素の消費を通じてATPの形で化学エネルギーを放出するプロセスである。 トリカルボン酸(TCA)サイクルを介したミトコンドリア内部の様々な基質の異化作用は、少数のATP分子を直接生成するが、むしろ電子伝達体ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)およびフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD+)の還元によってエネルギーを貯蔵する。次いで、還元された担体は、ミトコンドリアの内膜に位置するETCによって酸化され、膜を横切ってプロトン濃度勾配を生成する。プロトンは最終的にATP合成酵素を介してミトコンドリアマトリックスに勾配を流れ込み、ATPを生成する。OXPHOSは、エネルギー基質からのATP生産の最も効率的な手段であり、好気性環境で一般的に好ましい。以前は、好気性解糖系 - 酸素が存在する間にグルコースから乳酸を生成する - は病態生理学的であると考えられており、しばしば癌細胞の特徴である。いくつかの正常な細胞型が、まだ完全に解読されていない理由で好気性解糖系を使用することがますます発見されています。
代謝の柔軟性は、細胞または生物が変化するエネルギー需要および利用可能な燃料源に適応する能力である。例えば、骨格筋のエネルギー需要は、主に定常状態ではOXPHOSによって満たされるが、高強度運動中の嫌気性解糖系によって満たされる1。運動時間が長くなるにつれて、グルコースと脂肪酸の酸化は全体的なエネルギー生産に大きく寄与します2。しかしながら、基質の使用は、基質が酸化中に拮抗的に競合するため、入手可能性にのみ依存するものではない。最も顕著なのは、脂肪酸酸化が、ランドル効果3として知られる現象において骨格筋によるグルコース利用を阻害することが示されている。相反効果は、その後の研究4、5によって実証された。さらに、多くの疾患は、基質嗜好の変化および細胞における代謝不柔軟性の発症と関連している。例えば、脂肪酸酸化は、正常対照被験者6と比較してII型糖尿病患者の骨格筋において減少している。疾患設定における代謝変化は、病因に寄与する可能性があるため、激しい調査の対象となっている。
骨格細胞型におけるエネルギー代謝は比較的研究されていないが、近年注目されている7。これまでの研究は、好気性解糖系が歯蓋骨芽細胞における支配的なエネルギー経路であり、TCAサイクルを介したグルコース酸化が破骨細胞形成において役割を果たすことを示している8,9。その他は、骨芽細胞のエネルギー源としての脂肪酸の証拠を提供している10。グルタミン異化作用はまた、前駆細胞11、12からの骨芽細胞分化を支持することが示されている。しかしながら、様々な骨格細胞型による基質利用の包括的な理解は、依然として欠けている。さらに、細胞分化中または病理学的シグナルに応答した細胞代謝の変化は、燃料基質の利用率を変化させると予想される。以下に説明するのは、インビトロで基質酸化をアッセイするための使いやすいプロトコールです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

ミトコンドリアは、エネルギー恒常性を維持するためにアデノシン三リン酸(ATP)を生成するトリカルボン酸(TCA)サイクルと電子輸送鎖(ETC)の機構をホストします。グルコース、脂肪酸、およびアミノ酸は、ほとんどの体細胞においてミトコンドリア呼吸を促進する主要なエネルギー基質である。証拠は、異なる細胞型が特定の基質に対して明確な選好を有し得ることを示している。しかしながら、骨格中の各種細胞による基質利用は詳細に検討されていない。さらに、細胞代謝は生理学的および病態生理学的変化に順応しているため、骨格細胞における基質依存性の直接評価は、骨疾患の病因に関する重要な洞察を提供する可能性がある。
以下のプロトコールは、酸化的リン酸化に続く基質分子からの二酸化炭素放出の原理に基づいている。放射性標識された炭素原子(14C)を含む基質を使用することにより、この方法は、細胞培養における基質酸化速度について、高感度で使いやすいアッセイを提供する。原発性頭蓋骨前骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ(BMM)とのケーススタディは、2つの細胞型間で主要な基質の利用率が異なることを示しています。

この例では、CO2 トラップ法を使用して、原発性頭蓋骨前骨芽細胞による基質酸化と、それぞれ in vitro 骨芽細胞または破骨細胞分化に頻繁に使用されるBMMを比較する。初代細胞を継代し、cMEMα中で一晩培養した後、それらは典型的にはコンフルエントの80〜90%に達し、その特徴的な形態を示す。頭蓋骨前骨芽細胞はBMMよりも顕著に大きい(図2)。各細胞型は?...

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Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

このプロトコルは、インビトロで14CO2産生を追跡することによって基板酸化を調べるための使いやすい方法を記載している。

14CO2トラップによるインビトロでのエネルギー基板酸化の評価

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

異なるエネルギー基質の使用は、細胞型特異的および疾患指標の両方である。特定の基質の消費量を測定することは、正常な生物学と病理学の両方に光を当てることができます。この技術は特別な機器を必要とせず、スケーリングが容易です。また、以前に公開された方法よりも使いやすいです。基質酸化速度の変化を理解することは、代謝障害に対する食事的および薬理学的介入の開発を可能にするであろう。骨組織で実証されていますが、この技術は、代謝シフトの原因と結果の両方を理解するために、すべての細胞タイプの代謝柔軟性を研究するために容易にカスタマイズできます。生後3〜5日の子犬を犠牲にした後、ペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む氷冷D PBSに移す。皮膚および軟部組織を除去することによって頭蓋骨を露出させる。D PBSで周囲の組織を背中から前へ切断して中間領域を採取する。ピンセットを使用して頭蓋骨の内面と外面を優しく傷つけ、その後の消化時に細胞を解放するのを助けます。D PBS中のコラゲナーゼ2型1ミリリットル当たり2ミリグラムおよび4ミリグラムの溶液を調製し、各溶液を新鮮な0.22マイクロメートルフィルターで濾過する。まず、洗浄した頭蓋骨を1ミリリットルのコラゲナーゼ溶液2ミリグラムで15分間消化し、次いで消化液を捨てる。次に、清浄なサンプルを1ミリリットルあたり4ミリグラムのコラゲナーゼ溶液に3回ずつ15分間消化する。その後、消化液を引っ張って保存します。消化液を70マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、ろ液を300RCFで5分間遠心分離します。細胞ペレットを10%FBSおよびペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む完全なMEMアルファ培地に再懸濁する。細胞を数えて10センチメートルのプレートに播種する。細胞を摂氏37度のインキュベーターで5%二酸化炭素で3日間培養する。次いで、0.25トリプシンEDTAで摂氏37度で細胞を解離させる。消化後、細胞を数え、10%FBSおよびペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む完全なMEMアルファ培地で24ウェル細胞培養プレートに細胞を播種する。基質当たり細胞型当たり少なくとも4ウェルをシードし、プレアッセイ計数のために細胞タイプごとに少なくとも3つの余分なウェルをシードする。細胞を摂氏37度で一晩培養する。8週齢のマウスから筋肉と結合組織を除去し、大腿骨と脛骨を採取した後、鋭いはさみで骨の両端を切り取って捨てる。10%FBSペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液、および10%CGM 14 12馴化培地を含む15ミリリットルの完全なMEMアルファ培地を含む23ゲージ針を取り付けたシリンジを備えた新鮮な10センチメートルのペトリ皿に骨髄を洗い流す。シャーレ内の細胞を、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーター内で培養する。3日後、培養培地を捨て、細胞をD PBSでリンスした。付着した細胞を摂氏37度で0.25%トリプシンEDTAで5分間解離させる。遠心分離後、細胞ペレットをBMM培地に再懸濁する。細胞をカウントし、前述の手順に従って24ウェル細胞培養プレートに細胞を播種する。アッセイを開始する前にBMM培地中で摂氏37度で一晩培養した。余分なウェル内の細胞をD PBSで2回洗浄する。細胞を0.25%トリプシンEDTAで解離させる。20マイクロリットルの消化細胞をD PBSに再懸濁する。20マイクロリットルのアクリジンオレンジとヨウ化プロピジウム色素溶液を用いて、自動細胞カウンターで生細胞数を決定し、その数を記録する。アッセイウェル内の細胞をD PBSで2回洗浄する。500マイクロリットルの高温培地をRAM指定の組織培養フード内の各アッセイウェルに加える。プレートをパラフィルムで密封した後、RAM指定のインキュベーター内で細胞を摂氏37度で4時間インキュベートする。インキュベーション中は、ろ紙を1.5ミリリットルのマイクロ遠心管のキャップ内の面積よりわずかに大きい円形に切り、紙をキャップにぴったりと挿入します。各チューブに1モル過塩素酸100マイクロリットルを加え、キャップの内側に取り付けたろ紙に20マイクロリットルの水酸化ナトリウムを加える。細胞をインキュベートした後、各ウェルから調製したチューブに400マイクロリットルの培養培地を移し、直ちにキャップを閉じる。チューブを室温でチューブラックに1時間放置する。インキュベーション中の平行四辺形は、各チューブにシンチレーションバイアルをセットアップし、4ミリリットルのシンチレーション流体で満たします。ろ紙の各片をシンチレーションバイアルに移し、室温で30分間インキュベートする。組織培養フード、ウォーターバス、冷蔵庫、インキュベーター、シンク、地面、およびその他の作業領域で、RAM汚染の可能性についてワイプテストを実行します。紙ワイプをシンチレーション液を含むシンチレーションバイアルに入れます。シンチレーションバイアル中の炭素14放射活性をシンチレーションカウンターで測定し、読み取り結果を記録します。必要に応じて、放射線安全ガイドラインに従って作業環境を除染する。この図は、原発性頭蓋骨前骨芽細胞による基質酸化をBMMと比較したものである。初代細胞を継代し、完全なMEMアルファ培地中で一晩培養した後、それらは典型的には80〜90%のコンフルエントに達し、その特徴的な形態を示す。頭蓋骨前骨芽細胞はBMMよりも著しく大きい。基質酸化の結果は、各基質の酸化速度がBMMよりも歯槽前骨芽細胞において有意に高く、前骨芽細胞における酸化的リン酸化によるより高いエネルギー産生を示す可能性が高いことを示した。挿入された3番目の紙は、1.7ミリリットルのebinトップチューブキャップよりわずかに大きくする必要があります。この方法は、酸素消費と組み合わせて使用でき、細胞内の酸化的リン酸化および乳酸産生の全体的な速度を決定することができる。このプロトコルは、異なる分化段階または疾患設定中の基質使用を決定するために使用することができる。この知識により、代謝障害に対する介入を開発することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

生物学

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

マウス初代肝細胞における脂肪酸酸化および脂質生成の決意

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

大西洋サケにおける亜鉛の例を用いた相補的方法を用いた魚飼料の鉱物供給率の評価

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

FRET感作発光を伴う生細胞におけるタンパク質相互作用の評価(英語)

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

肥満マウスのエネルギーを消費する熱原性アディポサイトの基礎エネルギー支出と能力の決定

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

げっ歯類の頭部に定義された加速度を生成するための受動的頭部運動の適用

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...