Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

이 작업은 NIH 보조금 R01 AR060456 (FL)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 마이클 로빈슨 박사와 엘리자베스 크리즈만(필라델피아 아동 병원)에게 섬광 카운터에 대한 아낌없는 도움을 주신 것에 감사드립니다.

방사성 물질(RAM)을 사용하려면 각 기관의 지정된 안전위원회의 사전 승인이 필요합니다. 이 프로토콜에 사용되는 RAM은 펜실베니아 대학의 환경 보건 및 방사선 안전 (EHRS)의 승인을 받았습니다. 동물을 사용하려면 가정 기관의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 사전 승인이 필요합니다. 다음 연구는 필라델피아 아동 병원의 IACUC의 승인을 받았습니다.
1. 14C ...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. 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Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists.">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li><li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+osteoblast:+implications+for+osteoporosis.">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation.">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li><li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

이 프로토콜은 주요 에너지 기판의 산화 속도를 결정하는 데 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 중앙 우물을 포함하고 고무 마개14,15,16으로 덮인 플라스크를 사용하는 다른 프로토콜에 대한 간단한 대안입니다. 여기서 예시적인 연구가 세포 배양과 함께 수행되지만, 상기 방법은 앞서 기술된 바와 같이 무손상 미토콘드리아를...

진핵생물의 산화적 인산화(OXPHOS)는 미토콘드리아 내부에서 영양분이 분해되어 산소 소비를 통해 ATP 형태로 화학 에너지를 방출하는 과정입니다.  트리카르복실산(TCA) 사이클을 통해 미토콘드리아 내부의 다양한 기질의 이화작용은 직접 ATP 분자를 거의 생성하지 않지만, 오히려 전자 운반체인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD+)의 환원을 통해 에너지를 저장한다. 환원된 담체는 이어서 미토콘드리아의 내막에 위치한 ETC에 의해 산화되어 막을 가로질러 양성자 농도 구배를 생성한다. 양성자는 결국 ATP 신타제를 통해 미토콘드리아 매트릭스로 다시 구배를 흘러 ATP를 생성합니다. OXPHOS는 에너지 기질로부터 ATP를 생산하는 가장 효율적인 수단이며 일반적으로 호기성 환경에서 선호됩니다. 이전에, 호기성 글리코분해-산소가 존재하는 동안 글루코스로부터의 락테이트의 생산-병리생리학적, 종종 암 세포의 특징인 것으로 생각되었다. 점점 더 많은 수의 정상적인 세포 유형이 아직 완전히 해독되지 않은 이유로 호기성 글리코 분해를 사용한다는 것이 발견되고 있습니다.
대사 유연성은 세포 또는 유기체가 변화하는 에너지 요구와 사용 가능한 연료 원에 적응할 수있는 능력입니다. 예를 들어, 골격근의 에너지 수요는 주로 정상 상태에서 OXPHOS에 의해 충족되지만 고강도 운동 중 혐기성 당분해에 의해 충족됩니다1. 운동 기간이 증가함에 따라 포도당과 지방산 산화는 전반적인 에너지 생산에 더 많은 기여를합니다 2. 그러나, 기질 사용은 기질이 산화 동안 적대적으로 경쟁하기 때문에 가용성에만 의존하지 않는다. 가장 주목할 만하게, 지방산 산화는 랜들 효과3로 알려진 현상으로 골격근에 의한 글루코스 이용을 억제하는 것으로 나타났다. 상호 효과는 후속 연구 4,5에 의해 입증되었다. 또한, 많은 질병들은 기질 선호도의 변화 및 세포에서의 대사 유연성의 발달과 관련된다. 예를 들어, 지방산 산화는 정상 대조군 피험자6에 비해 II형 당뇨병 환자의 골격근에서 감소된다. 질병 설정의 대사 변화는 병인에 기여할 수 있기 때문에 집중적 인 조사의 대상입니다.
골격 세포 유형의 에너지 대사는 상대적으로 과소 연구되었지만 최근 몇 년 동안 주목을 받고 있습니다7. 이전의 연구는 호기성 당분해가 calvarial 조골 세포에서 지배적 인 에너지 경로이며, TCA 사이클을 통한 포도당 산화가 파골세포 형성 8,9에서 중요한 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 다른 사람들은 조골 세포10의 에너지 원으로서 지방산에 대한 증거를 제공했습니다. 글루타민 이화작용은 또한 선조(11,12)로부터의 조골세포 분화를 지지하는 것으로 나타났다. 그러나, 다양한 골격 세포 유형에 의한 기질 이용에 대한 포괄적인 이해는 여전히 부족하다. 또한, 세포 분화 동안 또는 병리학적 신호에 반응하여 세포 대사의 변화는 연료 기질 이용을 변화시킬 것으로 예상된다. 이하에 기재된 것은 시험관내에서 기질 산화를 검정하기 위한 사용하기 쉬운 프로토콜이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

미토콘드리아는 에너지 항상성을 유지하기 위해 아데노신 삼인산염(ATP)을 생성하는 트리카르복실산(TCA) 사이클 및 전자 수송 사슬(ETC)을 위한 기계장치를 호스트한다. 포도당, 지방산 및 아미노산은 대부분의 체세포에서 미토콘드리아 호흡을 촉진하는 주요 에너지 기질입니다. 증거는 상이한 세포 유형이 특정 기질에 대해 뚜렷한 선호도를 가질 수 있음을 보여준다. 그러나, 골격 내의 다양한 세포에 의한 기질 활용은 구체적으로 연구되지 않았다. 더욱이, 세포 대사가 생리학적 및 병리생리학적 변화에 적응함에 따라, 골격 세포에서의 기질 의존성에 대한 직접적인 평가는 뼈 질환의 발병기전에 대한 중요한 통찰을 제공할 수 있다.
다음 프로토콜은 산화 인산화 후 기질 분자로부터 이산화탄소가 방출되는 원리에 기초한다. 방사성으로 표지된 탄소 원자(14C)를 함유하는 기질을 사용함으로써, 이 방법은 세포 배양물에서 기질 산화의 속도에 대한 민감하고 사용하기 쉬운 검정을 제공한다. 일차 calvarial preosteoblasts 대 골수 유래 대식세포 (BMMs)를 사용한 사례 연구는 두 세포 유형 사이의 주요 기질의 다른 활용을 보여줍니다.

이 예에서,CO2 포획 방법은 각각 시험관내 조골세포 또는 파골세포 분화에 자주 사용되는 BMMs와 일차 갈변 전조골세포에 의한 기질 산화를 비교하기 위해 사용된다. 일차 세포가 계대배양되고 cMEMα에서 하룻밤 동안 배양된 후, 이들은 전형적으로 합류의 80-90%에 도달하고 그들의 특징적인 형태학을 나타낸다. calvarial preosteoblasts는 BMMs보다 현저하게 더 큽니다 (그림 2</s...

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Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

이 프로토콜은 시험관내에서 14CO2생산을 추적함으로써 기질 산화를 검사하는 사용하기 쉬운 방법을 기술한다.

14CO2트래핑을 사용한 시험관내 에너지 기질 산화 평가

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

상이한 에너지 기질의 사용은 세포 유형 특이적 및 질병 지시 둘 다이다. 특정 기질의 소비를 측정하면 정상적인 생물학과 병리학 모두에 빛을 비출 수 있습니다. 이 기술은 특수 장비가 필요하지 않으며 확장하기 쉽습니다.또한 이전에 게시 된 방법보다 사용하기가 더 쉽습니다. 기질 산화율의 변화를 이해하면 대사 장애에 대한식이 및 약리학 적 개입의 개발을 허용 할 것입니다. 비록 뼈 조직으로 입증되었지만, 이 기술은 대사 이동의 원인과 결과에 대한 이해를 제공하는 모든 세포 유형에서 대사 유연성을 연구하기 위해 쉽게 맞춤화된다.출생 후 삼 내지 오일 동안 새끼를 희생시킨 후, 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 얼음 차가운 D PBS로 옮긴다. 피부와 연조직을 제거하여 갈변을 노출시킵니다. D PBS에서 주위 조직을 뒤에서 앞쪽으로 절단하여 중간 영역을 수집한다.칼바리아의 내부 및 외부 표면을 핀셋을 사용하여 부드럽게 긁어 후속 소화시 세포를 방출하는 데 도움을줍니다. 콜라게나제 유형 2의 밀리리터 용액 당 2 및 4 밀리그램을 D PBS로 준비하고 각 용액을 신선한 0.22 마이크로미터 필터로 여과한다. 먼저, 세척 된 갈변을 밀리리터 콜라게나제 용액 당 두 밀리그램으로 15 분 동안 소화 한 다음 소화 용액을 버립니다.다음으로, 깨끗한 샘플을 매번 15분 동안 밀리리터 콜라게나제 용액 세 개당 네 밀리그램으로 소화한다. 그런 다음 소화 용액을 당겨 저장하십시오. 소화액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하고 여액을 300 RCF에서 5분 동안 원심분리한다.세포 펠릿을 10%FBS 및 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 완전한 MEM 알파 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 10 센티미터 플레이트에 시드하십시오. 세포를 섭씨 37도 배양기에서 3 일 동안 5 % 이산화탄소로 배양하십시오.그런 다음 섭씨 37도에서 세포를 0.25 트립신 EDTA와 해리시킵니다. 소화 후, 세포를 계수하고 10%FBS 및 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 완전한 MEM 알파 배지로 24웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 기질 당 세포 유형 당 적어도 네 개의 웰을 시드하고, 사전 분석 계수를 위해 각 세포 유형에 대해 적어도 세 개의 여분의 웰을 시드한다.세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 여덟 주령의 생쥐에서 근육과 결합 조직을 제거하고 대퇴골과 흉골을 수집 한 후 날카로운 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자르고 버립니다. 하나의 대퇴골과 한 경골에서 골수를 10 % FBS 페니실린 스트렙토 마이신 이중 항생제 용액과 10 % CGM 14 12 컨디셔닝 배지가있는 완전한 MEM 알파 배지 15 밀리리터가 들어있는 23 게이지 바늘이 장착 된 주사기가 장착 된 신선한 10 센티미터 페트리 접시에 씻어 내십시오.세포를 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도 배양기에서 페트리 접시에 배양하십시오. 사흘 후 배양 배지를 버리고 D PBS로 세포를 헹구었다. 부착 된 세포를 섭씨 37도에서 0.25 % 트립신 EDTA와 5 분 동안 해리시킵니다.원심분리 후, 세포 펠릿을 BMM 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 이전에 기술된 절차에 따라 24 웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 분석을 시작하기 전에 BMM 배지에서 밤새 섭씨 37도에서 배양하였다.여분의 웰에서 세포를 D PBS로 두 번 세척한다. 세포를 0.25 % 트립신 EDTA와 해리시킵니다. 소화된 세포 20 마이크로리터를 D PBS에 재현탁시킨다.20 마이크로 리터의 아크리딘 오렌지와 프로피듐 요오드화물 염료 용액으로 자동화 된 세포 카운터로 살아있는 세포의 수를 결정하고 숫자를 기록하십시오. 분석 웰에서 세포를 D PBS로 두 번 세척한다. 500 마이크로리터의 고온 배지를 RAM 지정 조직 배양 후드의 각 분석 웰에 첨가한다.플레이트를 파라필름으로 밀봉한 후, 세포를 섭씨 37도에서 RAM 지정 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 중에 여과지를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브의 캡 내부 영역보다 약간 큰 원형 조각으로 자르고 종이를 뚜껑에 꼭 삽입하십시오. 각 튜브에 1 몰 과염소산 200 마이크로 리터를 넣고 뚜껑 내부에 장착 된 여과지에 20 마이크로 리터의 수산화 나트륨을 넣으십시오.세포를 배양한 후, 각 웰에서 400 마이크로리터의 배양 배지를 준비된 튜브로 옮기고 즉시 캡을 닫는다. 튜브를 실온에서 한 시간 동안 튜브 랙에 두십시오. 인큐베이션 중 Parallelae는 각 튜브에 대한 섬광 바이알을 설치하고 네 밀리리터의 섬광 유체로 채 웁니다.여과지의 각 조각을 섬광 바이알로 옮기고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 조직 배양 후드, 수조, 냉장고, 인큐베이터, 싱크대, 접지 및 기타 작업 영역에서 잠재적인 RAM 오염에 대한 닦아 테스트를 수행합니다. 종이 물티슈를 섬광액이 들어있는 섬광 바이알에 넣으십시오.섬광 계수기를 사용하여 섬광 바이알에서 탄소 14 전파 활동을 측정하고 판독 결과를 기록하십시오. 필요한 경우 방사선 안전 지침에 따라 작업 환경의 오염을 제거하십시오. 이 그림은 일차 칼바리아 예비 조골세포에 의한 기질 산화와 BMM을 비교합니다.일차 세포가 계대배양되고 완전한 MEM 알파 배지에서 하룻밤 동안 배양된 후, 이들은 전형적으로 80 내지 90%컨플루언시에 도달하고 이들의 특징적인 형태학을 나타낸다. calvarial pre osteoblasts는 BMMs보다 현저하게 더 큽니다. 기질 산화의 결과는 각 기질에 대한 산화 속도가 BMMs보다 칼바리알 예비 조골세포에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었고, 이는 조골 전 세포에서의 산화 인산화에 의한 더 높은 에너지 생산을 나타낼 가능성이 높다.삽입 된 세 번째 용지는 1.7 밀리리터 에빈 탑 튜브 캡보다 약간 커야합니다. 이 방법은 산소 소비와 함께 사용될 수 있으며 세포에서 산화 인산화 및 젖산 생산의 전체 속도를 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 별개의 분화 단계 또는 질병 설정 동안 기질 사용을 결정하는데 사용될 수 있다.이 지식으로 우리는 신진 대사 장애에 대한 중재를 개발할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

연구

생물학

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

형광 공명 에너지 전송과 리간드 - 수용체 상호 작용의 실시간 모니터링

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

대서양 연어의 아연의 예로 입증 된 보완 적 방법을 사용하여 물고기 사료의 미네랄 가용성 평가

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

재조합 퍼프렌고리신 O-퍼메아빌화 세포에서 미토콘드리아 기질 플럭스 측정

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

비만 마우스에 있는 에너지를 소모하기 위하여 기저 에너지 지출 및 열발생 성 지방세포의 용량을 결정합니다

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

설치류의 머리에서 정의된 가속도를 생성하기 위한 수동 머리 움직임의 적용

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...