Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

Arbeidet ble delvis støttet av NIH grant R01 AR060456 (FL). Vi takker Dr. Michael Robinson og Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) for deres generøse hjelp med scintillation counter.

Bruk av radioaktivt materiale (RAM) krever forhåndsgodkjenning av en utpekt sikkerhetskomité ved hver institusjon. RAMs som brukes i denne protokollen er godkjent av Environmental Health &Radiation Safety (EHRS) ved University of Pennsylvania. Bruk av dyr krever forhåndsgodkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved hjemmeinstitusjonen. Følgende studie ble godkjent av IACUC ved The Children's Hospital of Philadelphia.
1. Utarbeidelse av lagerløsninger for <s...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus.">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li><li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids,+ketone+bodies+and+pyruvate,+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation,+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles.">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists.">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li><li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+osteoblast:+implications+for+osteoporosis.">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation.">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li><li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

Protokollen gir en brukervennlig metode for å bestemme oksidasjonshastigheten til store energisubstrater. Det er et enklere alternativ til andre protokoller som bruker kolber som inneholder en sentral brønn og avkortet med gummipropper 14,15,16. Selv om eksempelstudien her utføres med cellekultur, kan metoden enkelt tilpasses vevseksempler eller vevshomogenater som inneholder intakt mitokondrier, som tidligere beskrevet<sup c...

Oksidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter er prosessen der næringsstoffer brytes ned inne i mitokondrier for å frigjøre kjemisk energi i form av ATP gjennom forbruk av oksygen.  Katabolisme av ulike substrater inne i mitokondrier gjennom trikarboksylsyre (TCA) syklusen genererer få ATP molekyler direkte, men lagrer heller energi gjennom reduksjon av elektron bærere nikotinamid adenin dinucleotide (NAD +) og flavin adenine dinucleotide (FAD +). De reduserte bærerne oksideres deretter av ETC plassert på den indre membranen av mitokondrier for å generere en protonkonsentrasjonsgradient over membranen. Protonene strømmer til slutt ned gradienten tilbake til mitokondriematrisen gjennom ATP-syntase for å produsere ATP. OXPHOS er den mest effektive måten å produsere ATP på fra energisubstrater og generelt foretrekkes i aerobe miljøer. Tidligere ble aerob glykolyseproduksjon av laktat fra glukose mens oksygen er tilstede- antatt å være patofysiologisk, ofte et kjennetegn på kreftceller. Mer og mer blir det oppdaget at noen normale celletyper bruker aerob glykolyse av grunner som ennå ikke er fullstendig dechiffrert.
Metabolsk fleksibilitet er kapasiteten for celler eller organismer til å tilpasse seg endrede energibehov og tilgjengelige drivstoffkilder. For eksempel blir den energiske etterspørselen av skjelettmuskulatur hovedsakelig møtt av OXPHOS ved steady state, men av anaerob glykolyse under høyintensitets trening1. Etter hvert som treningsvarigheten øker, bidrar glukose og fettsyreoksidasjon mer til den totale energiproduksjonen2. Substratbruk er imidlertid ikke bare avhengig av tilgjengelighet, da substrater antagonistisk konkurrerer under oksidasjon. Spesielt har fettsyreoksidasjon vist seg å hemme glukoseutnyttelse ved skjelettmuskulatur i et fenomen kjent som Randle-effekten3. En gjensidig effekt ble demonstrert ved senere studier 4,5. I tillegg er mange sykdommer forbundet med en endring i substratpreferanse og utvikling av metabolsk ufleksibilitet i celler. For eksempel reduseres fettsyreoksidasjon i skjelettmuskelen til type II diabetikerpasienter sammenlignet med normale kontrollpersoner6. De metabolske endringene i sykdomsmiljøer er gjenstand for intens undersøkelse, da de kan bidra til patogenese.
Energimetabolismen i skjelettcelletyper er relativt undervurdert, men har fått oppmerksomhet de siste årene7. Tidligere arbeid har vist at aerob glykolyse er den dominerende energiveien i kalori osteoblaster, mens glukoseoksidasjon gjennom TCA-syklusen spiller en rolle i osteoklastdannelse 8,9. Andre har gitt bevis for fettsyrer som energikilde for osteoblaster10. Glutamin katabolisme har også vist seg å støtte osteoblast differensiering fra forfedrene11,12. Imidlertid mangler en omfattende forståelse av substratutnyttelse av ulike skjelettcelletyper fortsatt. I tillegg forventes endringer i cellulær metabolisme under celledifferensiering eller som svar på patologiske signaler å endre bruken av drivstoffsubstrat. Beskrevet nedenfor er en brukervennlig protokoll for analyse av substratoksidasjonsintro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

Mitokondrier er vert for maskineriet for trikarboksylsyre (TCA) syklus og elektron transportkjede (ETC), som genererer adenosintrifosfat (ATP) for å opprettholde energi homeostase. Glukose, fettsyrer og aminosyrer er de viktigste energisubstratene som driver mitokondrie respirasjon i de fleste somatiske celler. Bevis viser at forskjellige celletyper kan ha en tydelig preferanse for visse substrater. Substratutnyttelse av ulike celler i skjelettet er imidlertid ikke studert i detalj. Videre, ettersom cellulær metabolisme er tilpasset fysiologiske og patofysiologiske endringer, kan direkte vurderinger av substratavhengighet i skjelettceller gi viktig innsikt i patogenesen av beinsykdommer.
Følgende protokoll er basert på prinsippet om karbondioksidfrigjøring fra substratmolekyler etter oksidativ fosforylering. Ved å bruke substrater som inneholder radioaktivt merkede karbonatomer (14C), gir metoden en sensitiv og brukervennlig analyse for substratoksidasjonsraten i cellekulturen. En casestudie med primære calvariale preosteoblaster versus benmargsavledede makrofager (BMMer) viser forskjellig utnyttelse av hovedsubstratene mellom de to celletypene.

I dette eksemplet brukes CO2-overlappingsmetoden til å sammenligne substratoksidasjon ved henholdsvis primære kaloripreosteoblaster versus BMMer, som ofte brukes til henholdsvis in vitro osteoblast eller osteoklastdifferensiering. Etter at primærcellene er passeret og dyrket i cMEMα over natten, når de vanligvis 80-90% av samløpet og viser sin karakteristiske morfologi. De kaloriprevariale preosteoblastene er merkbart større enn BMMer (figur 2). Hver celletype utse...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping at JoVE.com

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Denne protokollen beskriver en brukervennlig metode for å undersøke substratoksidasjon ved å spore 14CO2 produksjonsintro.

Vurdering av energisubstratoksidasjon in vitro med 14CO2-fangst

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

Bruk av ulike energisubstrater er både celletypespesifikk og sykdomsindekseringsmiddel. Måling av forbruket av de spesifikke substratene kan kaste lys over både normal biologi og patologi. Teknikken trenger ikke spesialisert utstyr og er lett å skalere.Det er også enklere å bruke enn tidligere publiserte metoder. Å forstå endringer i substratoksidasjonshastigheten vil tillate utvikling av kostholds- og farmakologiske intervensjoner for metabolske forstyrrelser. Selv om demonstrert med beinvev denne teknikken er lett tilpasset å studere metabolsk fleksibilitet i alle celletyper som gir en forståelse av både årsakene og konsekvensene av metabolske skift.Etter å ha ofret valpene på tre til fem barseldager, overfør dem til iskald D PBS som inneholder penicillin streptomycin dobbel antibiotikaløsning. Utsett calvaria ved å fjerne huden og bløtvevet. Samle den midterste regionen ved å kutte det omkringliggende vevet fra baksiden til forsiden i D PBS.Skrap de indre og ytre overflatene på calvaria forsiktig ved hjelp av pinsett for å frigjøre cellene ved etterfølgende fordøyelse. Forbered 2 og 4 milligram per milliliter løsninger av kollagenaliser type to i D PBS og filtrer hver løsning med et friskt 0,22 mikrometer filter. Først fordøyer du den rensede calvaria med to milligram per milliliter kollagenalenseløsning i 15 minutter, og kaster deretter fordøyelsesoppløsningen.Deretter fordøyer du de rene prøvene i fire milligram per milliliter kollagenaseoppløsning tre ganger i 15 minutter hver gang. Trekk deretter fordøyelsesløsningen og lagre den. Filtrer fordøyelsesløsningen gjennom 70 mikrometer cellesiler og sentrifuger filtratet ved 300 RCF i fem minutter.Re suspendere cellepellet i komplett MEM alfa medium som inneholder 10% FBS og penicillin streptomycin dual antibiotika løsning. Tell og frø cellene i en 10 centimeter plate. Kultur cellene i en 37 grader Celsius inkubator med 5% karbondioksid i tre dager.Deretter dissosierer cellene ved 37 grader Celsius med 0,25 Trypsin EDTA. Etter fordøyelsen, telle og frø cellene i en 24 brønncelle kulturplate med en komplett MEM alfa medium som inneholder 10% FBS og penicillin streptomycin dual antibiotika løsning. Frø minst fire brønner per celletype per substrat, og minst tre ekstra brønner for hver celletype for preanalysetelling.Kultur cellene på 37 grader Celsius over natten. Etter å ha fjernet muskelen og bindevevet fra åtte uker gamle mus og samle lårben og tibias, kutt og kast begge ender av beinene med skarp saks. Skyll ut benmargen fra en lårben og en tibia i en frisk 10 centimeter Petri-tallerken med en sprøyte utstyrt med en 23 gauge nål som inneholder 15 milliliter komplett MEM alfamedium med 10% FBS penicillin streptomycin dobbel antibiotikaløsning og 10% CGM 14 12 betinget medium.Kultur cellene i Petri parabolen i en 37 grader Celsius inkubator med 5% karbondioksid. Etter tre dager kaste kulturmediene og skyll cellene med D PBS. Fjern de vedlagte cellene ved 37 grader Celsius med 0,25% Trypsin EDTA i fem minutter.Etter sentrifugering, re suspender cellepellet i BMM-mediet. Tell og frø cellene i en 24 brønncellekulturplate i henhold til prosedyren som er beskrevet tidligere. Kultur ved 37 grader Celsius over natten i BMM-mediet før du starter analysene.Vask cellene i de ekstra brønnene to ganger med D PBS. Fjern cellene med 0,25 % Trypsin EDTA. Re suspendere 20 mikroliter av fordøyde celler i D PBS.Med 20 mikroliter acridine oransje og propidiumjodidfargeoppløsning, bestem antall levende celler med en automatisert celleteller og registrer tallet. Vask cellene i analysebrønnene to ganger med D PBS. Tilsett 500 mikroliter varmt medium til hver analyse godt i RAM-utpekt vevskulturhette.Etter å ha forseglet platen med parafilm, inkuber cellene i en RAM-utpekt inkubator ved 37 grader Celsius i 4 timer. Under inkubasjon, kutt filterpapir i sirkulære stykker, litt større enn området inne i hetten på det 1,5 milliliter mikrosentrifugerrøret og sett papiret tett inn i hetten. Tilsett 200 mikroliter av en 1 molar perklorsyre til hvert rør og 20 mikroliter natriumhydroksid til filterpapiret som er montert inne i hetten.Etter inkubering av cellene, overfør 400 mikroliter kulturmedium fra hver brønn til de forberedte rørene og lukk hettene umiddelbart. La rørene ligge i et rørstativ ved romtemperatur i en time. Parallelae under inkubasjon setter opp et scintillation hetteglass for hvert rør og fyll det med fire milliliter scintillation væske.Overfør hvert stykke filterpapir til et scintillation hetteglass og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Utfør tørketester på vevskulturhetten, vannbadet, kjøleskapet, inkubatoren, vasken, bakken og andre arbeidsområder for potensiell RAM-forurensning. Sett papirservietter i scintillation hetteglass som inneholder scintillation væske.Mål karbon 14-radioaktivitet i hetteglassene med en scintillasjonsteller og registrer leseresultatene. Dekontaminere arbeidsmiljøet, i henhold til retningslinjene for strålesikkerhet, om nødvendig. Figuren sammenligner substratoksidasjon med primære calvaria pre osteoblaster versus BMMs.Etter at primærcellene er passert og dyrket i komplett MEM alfa medium over natten, når de vanligvis 80 til 90% samløp og viser sin karakteristiske morfologi. Calvarial pre osteoblaster er spesielt større enn BMMs. Resultatene av substratoksidasjon viste at oksidasjonshastigheten for hvert substrat er betydelig høyere i calvarial pre osteoblaster enn BMMs, noe som sannsynligvis indikerer høyere energiproduksjon ved oksidativ fosforylering i pre osteoblaster.Det innsatte tredje papiret skal være litt større enn en 1,7 milliliter ebin topprørhette. Denne metoden kan brukes sammen med oksygenforbruk og for å bestemme den totale frekvensen av oksidativ fosforylering og laktativ produksjon i cellene. Denne protokollen kan brukes til å bestemme substratbruk under distinkte differensieringsstadier eller sykdomsinnstillinger.Med denne kunnskapen kan vi utvikle intervensjoner for metabolske forstyrrelser.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time overvåkning av Ligand-reseptor interaksjoner med Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Gene Fangst Bruke Gal4 i sebrafisk

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bestemmelse av fettsyreoksidasjon og lipogenese i Mouse primære hepatocytter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling av energi Metabolism i Explanted netthinnen vev ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Vurdering av mineraltilgjengelighet i fiskefôr ved hjelp av komplementære metoder demonstrert med eksempel på sink i atlantisk laks

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Vurdering av proteininteraksjoner i levende celler med FRET-sensibilisert utslipp

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Måling av mitokondrie substrat flux i rekombinante perfringolysin O-permeabiliserte celler

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Bestemme Basal energiutgifter og kapasiteten til thermogenic Adipocytes å bruke energi i overvektige mus

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Påføring av passiv hodebevegelse for å generere definerte akselerasjoner ved gnagernes hoder

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...