Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
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O trabalho foi apoiado em parte pela concessão do NIH R01 AR060456 (FL). Agradecemos ao Dr. Michael Robinson e Elizabeth Krizman (Hospital Infantil da Filadélfia) por sua generosa ajuda com o contador de cintilação.

O uso de materiais radioativos (RAM) requer aprovação prévia por um comitê de segurança designado em cada instituição. Os RAMs usados neste protocolo foram aprovados pela Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) na Universidade da Pensilvânia. O uso de animais requer aprovação prévia do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) na instituição de origem. O estudo seguinte foi aprovado pela IACUC no Hospital Infantil da Filadélfia.
1. Preparação de s...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. 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Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists.">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li><li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+osteoblast:+implications+for+osteoporosis.">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation.">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li><li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

O protocolo fornece um método fácil de usar para determinar a taxa de oxidação dos principais substratos de energia. É uma alternativa mais simples a outros protocolos que usam frascos contendo um poço central e tampados com rolhas de borracha 14,15,16. Embora o exemplo de estudo aqui seja realizado com cultura celular, o método pode ser facilmente adaptado para explantos teciduais ou homogeneizadores de tecidos contendo ...

A fosforilação oxidativa (OXPHOS) em eucariotes é o processo pelo qual os nutrientes são divididos dentro das mitocôndrias para liberar energia química na forma de ATP através do consumo de oxigênio.  O catabolismo de vários substratos dentro das mitocôndrias através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) gera poucas moléculas de ATP diretamente, mas armazena energia através da redução dos portadores de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) e dinucleotídeo de adenina flavin (FAD+). Os portadores reduzidos são então oxidados por ETC localizados na membrana interna das mitocôndrias para gerar um gradiente de concentração de prótons através da membrana. Os prótons eventualmente fluem de volta para a matriz mitocondrial através da synthase ATP para produzir ATP. Oxphos é o meio mais eficiente de produção de ATP a partir de substratos de energia e geralmente preferido em ambientes aeróbicos. Anteriormente, a produção de glicólise aeróbica de lactato a partir da glicose, enquanto o oxigênio está presente- pensava-se ser fiofosiológica, muitas vezes uma marca registrada das células cancerosas. Cada vez mais, está sendo descoberto que alguns tipos normais de células usam glicolise aeróbica por razões que ainda não foram totalmente decifradas.
Flexibilidade metabólica é a capacidade de células ou organismos se adaptarem às mudanças nas demandas energéticas e às fontes de combustível disponíveis. Por exemplo, a demanda energética do músculo esquelético é atendida principalmente pelo OXPHOS em estado estável, mas por glicólise anaeróbica durante o exercício de alta intensidade1. À medida que a duração do exercício aumenta, a oxidação da glicose e do ácido graxo contribuem mais para a produção global de energia2. No entanto, o uso de substrato não depende apenas da disponibilidade, pois substratos competem antagonistamente durante a oxidação. Mais notavelmente, a oxidação por ácidos graxos tem sido demonstrada para inibir a utilização da glicose pelo músculo esquelético em um fenômeno conhecido como efeito Randle3. Um efeito recíproco foi demonstrado pelos estudos subsequentes 4,5. Além disso, muitas doenças estão associadas à mudança na preferência por substrato e ao desenvolvimento da inflexibilidade metabólica nas células. Por exemplo, a oxidação por ácidos graxos é reduzida no músculo esquelético dos pacientes diabéticos tipo II em comparação com os sujeitos de controle normal6. As alterações metabólicas nos cenários da doença são objeto de intensa investigação, pois podem contribuir para a patogênese.
O metabolismo energético nos tipos de células esqueléticas é relativamente pouco estudado, mas ganhou atenção nos últimos anos7. Trabalhos anteriores mostraram que a glicólise aeróbica é a via de energia dominante nos osteoblastos calvariais, enquanto a oxidação da glicose através do ciclo TCA desempenha um papel na formação osteoclasta 8,9. Outros forneceram evidências de ácidos graxos como fonte de energia para os osteoblastos10. O catabolismo da glutamina também tem sido demonstrado para apoiar a diferenciação do osteoblasto dos progenitores11,12. No entanto, ainda falta uma compreensão abrangente da utilização de substratos por vários tipos de células esqueléticas. Além disso, espera-se que mudanças no metabolismo celular durante a diferenciação celular ou em resposta a sinais patológicos alterem a utilização do substrato de combustível. Descrito abaixo é um protocolo fácil de usar para avaliar a oxidação de substrato in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

Mitocôndrias hospedam o maquinário para o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte de elétrons (ETC), que geram triptosfato de adenosina (ATP) para manter a homeostase energética. Glicose, ácidos graxos e aminoácidos são os principais substratos de energia que alimentam a respiração mitocondrial na maioria das células somáticas. Evidências mostram que diferentes tipos de células podem ter uma preferência distinta por certos substratos. No entanto, a utilização do substrato por várias células no esqueleto não foi estudada em detalhes. Além disso, como o metabolismo celular está sintonizado com alterações fisiológicas e fisiodicos, avaliações diretas da dependência de substratos em células esqueléticas podem fornecer insights importantes sobre a patogênese das doenças ósseas.
O protocolo a seguir baseia-se no princípio da liberação de dióxido de carbono de moléculas de substrato após a fosforilação oxidativa. Ao usar substratos contendo átomos de carbono radioativos rotulados (14C), o método fornece um ensaio sensível e fácil de usar para a taxa de oxidação de substrato na cultura celular. Um estudo de caso com preosteoblasts primários do calvário versus macrófagos derivados da medula óssea (MMC) demonstra diferente utilização dos principais substratos entre os dois tipos de células.

Neste exemplo, o método de captura de CO2 é usado para comparar a oxidação do substrato por preosteoblasts pré-sísceros do calvário primário versus BMMs, que são frequentemente usados para a diferenciação de osteoblasto in vitro ou osteoclasta, respectivamente. Depois que as células primárias são passaged e cultivadas em cMEMα durante a noite, elas normalmente atingem 80-90% de confluência e exibem sua morfologia característica. Os preosteoblastas calvariais são notavelmente maiores ...

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Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Este protocolo descreve um método fácil de usar para examinar a oxidação do substrato rastreando a produção de 14CO2 in vitro.

Avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com 14armadilhas de CO2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

O uso de diferentes substratos de energia é tanto tipo celular específico quanto indicativo de doença. Medir o consumo dos substratos específicos pode lançar luz sobre a biologia normal e a patologia. A técnica não precisa de equipamentos especializados e é fácil de escalar.Também é mais fácil de usar do que os métodos publicados anteriormente. A compreensão das mudanças na taxa de oxidação do substrato permitirá o desenvolvimento de intervenções dietéticas e farmacológicas para distúrbios metabólicos. Embora demonstrada com tecido ósseo esta técnica é facilmente personalizada para estudar a flexibilidade metabólica em todos os tipos de células, proporcionando uma compreensão das causas e consequências das mudanças metabólicas.Depois de sacrificar os filhotes de três a cinco dias pós-natal, transfira-os para o frio d pbs frio contendo penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Exponha a calvária removendo a pele e o tecido mole. Colete a região média cortando os tecidos circundantes de trás para frente em D PBS.Coce as superfícies internas e externas da calvária suavemente usando pinças para ajudar a liberar as células após a digestão subsequente. Prepare 2 e 4 miligramas por mililitro de soluções de colagenase tipo dois em D PBS e filtre cada solução com um filtro fresco de 0,22 micrômetros. Primeiro, digerir a calvaria limpa com dois miligramas por solução de colagem mililitro por 15 minutos e, em seguida, descartar a solução de digestão.Em seguida, digerir as amostras limpas em quatro miligramas por solução de colagenase mililitro três vezes por 15 minutos cada vez. Em seguida, puxe a solução de digestão e salve-a. Filtre a solução de digestão através de cepas de células de 70 micrômetros e centrífugue o filtrado a 300 RCF por cinco minutos.Suspender a pelota celular em meio alfa MEM completo contendo 10% FBS e penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Conte e semee as células em uma placa de 10 centímetros. Cultume as células em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono por três dias.Em seguida, dissociar as células a 37 graus Celsius com 0,25 Trypsin EDTA. Após a digestão, conte e semente as células em uma placa de cultura de 24 poços com um meio alfa MEM completo contendo 10% FBS e penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Semente pelo menos quatro poços por tipo de célula por substrato, e pelo menos três poços extras para cada tipo de célula para contagem pré-ensaio.Cultume as células a 37 graus Celsius durante a noite. Depois de remover o músculo e o tecido conjuntivo de camundongos de oito semanas de idade e coletar fêmures e tíbias, corte e descarte ambas as extremidades dos ossos com uma tesoura afiada. Limpe a medula óssea de um fêmur e uma tíbia em uma placa de Petri fresca de 10 centímetros com uma seringa equipada com uma agulha de calibre 23 contendo 15 mililitros de meio alfa MEM completo com 10% FBS penicilina dupla solução antibiótico, e 10% CGM 14 12 meio condicionado.Cultume as células da placa de Petri em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após três dias, descarte os meios de cultura e enxágue as células com D PBS. Dissociar as células anexadas a 37 graus Celsius com 0,25% Trypsin EDTA por cinco minutos.Após a centrifugação, suspenda a pelota celular no meio BMM. Conte e semee as células em uma placa de cultura de 24 poços de células pelo procedimento descrito anteriormente. Cultura a 37 graus Celsius durante a noite no meio BMM antes de iniciar os ensaios.Lave as células nos poços extras duas vezes com D PBS. Dissociar as células com 0,25% Trypsin EDTA. Suspender 20 microliters de células digeridas em D PBS.Com 20 microliters de laranja acridina e solução de corante de ióide de propídio, determine o número de células vivas com um contador celular automatizado e registe o número. Lave as células nos poços de ensaio duas vezes com D PBS. Adicione 500 microliters de meio quente a cada ensaio bem na capa de cultura de tecido designada RAM.Depois de selar a placa com parafilme, incubar as células em uma incubadora designada RAM a 37 graus Celsius por 4 horas. Durante a incubação, corte o papel filtro em pedaços circulares, ligeiramente maior que a área dentro da tampa do tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro e insira o papel na tampa. Adicione 200 microlitres de um molar ácido perpólorico a cada tubo e 20 microlitres de hidróxido de sódio ao papel filtro instalado dentro da tampa.Após a incubação das células, transfira 400 microliters de meio de cultura de cada poço para os tubos preparados e feche as tampas imediatamente. Deixe os tubos em um rack de tubo em temperatura ambiente por uma hora. Paralelamente durante a incubação configure um frasco de cintilação para cada tubo e preencha-o com quatro mililitros de fluido de cintilação.Transfira cada pedaço de papel filtro para um frasco de cintilação e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Realize testes de limpeza na capa da cultura tecidual, no banho de água, geladeira, incubadora, pia, no chão e em qualquer outra área de trabalho para possível contaminação por RAM. Coloque os lenços de papel em frascos de cintilação contendo fluido de cintilação.Meça a atividade de rádio carbono 14 nos frascos de cintilação com um contador de cintilação e regissuça os resultados da leitura. Descontaminar o ambiente de trabalho, de acordo com as diretrizes de segurança da radiação, se necessário. A figura compara a oxidação do substrato por pré-osteoblastos de calvaria primária versus BMMs.Depois que as células primárias são permeadas e cultivadas em meio alfa MEM completo durante a noite, elas normalmente atingem 80 a 90% de confluência e exibem sua morfologia característica. Os pré-osteoblastos calvariais são notavelmente maiores que os MMMs. Os resultados da oxidação do substrato mostraram que a taxa de oxidação para cada substrato é significativamente maior em pré-osteoblastos calvariais do que os MMM, provavelmente indicando maior produção de energia por fosforilação oxidativa nos pré-osteoblastos.O terceiro papel inserido deve ser ligeiramente maior do que uma tampa de tubo de ebin de 1,7 mililitro. Este método pode ser usado em conjunto com o consumo de oxigênio e para determinar a taxa global de fosforilação oxidativa e produção lactativa nas células. Este protocolo pode ser usado para determinar o uso de substratos durante estágios distintos de diferenciação ou configurações de doenças.Com esse conhecimento podemos desenvolver intervenções para distúrbios metabólicos.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Biologia

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Gene Trapping Usando Gal4 em Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Avaliação da disponibilidade mineral em rações de peixe usando métodos complementares demonstrados com o exemplo de zinco no salmão atlântico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Determinando o gasto energético basal e a capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia em camundongos obesos

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Aplicação do movimento passivo da cabeça para gerar acelerações definidas nas cabeças dos roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...