Name: assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00
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El trabajo fue apoyado en parte por la subvención R01 AR060456 (FL) de los NIH. Agradecemos al Dr. Michael Robinson y Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) por su generosa ayuda con el mostrador de centelleo.

El uso de materiales radiactivos (RAM) requiere la aprobación previa de un comité de seguridad designado en cada institución. Las RAM utilizadas en este protocolo han sido aprobadas por Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) en la Universidad de Pensilvania. El uso de animales requiere la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la institución de origen. El siguiente estudio fue aprobado por IACUC en el Hospital de Niños de Filadelfia.
<st...

<ol>
	<li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise.">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li><li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle.">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li><li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. 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Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li><li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists.">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li><li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+osteoblast:+implications+for+osteoporosis.">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation.">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li><li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts.">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).</li><li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner.">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts.">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo.">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li><li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+glucose,+glutamate,+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels.">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines.">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li><li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults.">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).</li></ol>

El protocolo proporciona un método fácil de usar para determinar la tasa de oxidación de los principales sustratos energéticos. Es una alternativa más sencilla a otros protocolos que utilizan matraces que contienen un pozo central y están tapados con tapones de goma 14,15,16. Aunque el estudio de ejemplo aquí se realiza con cultivo celular, el método se puede adaptar fácilmente para explantes de tejido u homogeneizados ...

La fosforilación oxidativa (OXPHOS) en eucariotas es el proceso por el cual los nutrientes se descomponen dentro de las mitocondrias para liberar energía química en forma de ATP a través del consumo de oxígeno.  El catabolismo de varios sustratos dentro de las mitocondrias a través del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) genera pocas moléculas de ATP directamente, pero más bien almacena energía a través de la reducción de los portadores de electrones nicotinamida adenina dinucleótido (NAD +) y flavina adenina dinucleótido (FAD +). Los portadores reducidos son oxidados por ETC ubicado en la membrana interna de las mitocondrias para generar un gradiente de concentración de protones a través de la membrana. Los protones eventualmente fluyen por su gradiente de regreso a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa para producir ATP. OXPHOS es el medio más eficiente de producción de ATP a partir de sustratos energéticos y generalmente se prefiere en entornos aeróbicos. Anteriormente, se pensaba que la glucólisis aeróbica (producción de lactato a partir de glucosa mientras el oxígeno está presente) era fisiopatológica, a menudo un sello distintivo de las células cancerosas. Cada vez más, se está descubriendo que algunos tipos de células normales utilizan la glucólisis aeróbica por razones que aún no se han descifrado por completo.
La flexibilidad metabólica es la capacidad de las células u organismos para adaptarse a las cambiantes demandas de energía y las fuentes de combustible disponibles. Por ejemplo, la demanda energética del músculo esquelético es satisfecha principalmente por OXPHOS en estado estacionario, pero por glucólisis anaeróbica durante el ejercicio de alta intensidad1. A medida que aumenta la duración del ejercicio, la glucosa y la oxidación de ácidos grasos contribuyen más a la producción general de energía2. Sin embargo, el uso del sustrato no depende solo de la disponibilidad, ya que los sustratos compiten antagónicamente durante la oxidación. En particular, se ha demostrado que la oxidación de ácidos grasos inhibe la utilización de glucosa por el músculo esquelético en un fenómeno conocido como el efecto Randle3. Un efecto recíproco fue demostrado por estudios posteriores 4,5. Además, muchas enfermedades se asocian con un cambio en la preferencia de sustrato y el desarrollo de inflexibilidad metabólica en las células. Por ejemplo, la oxidación de ácidos grasos se reduce en el músculo esquelético de los pacientes diabéticos tipo II en comparación con los sujetos de control normales6. Los cambios metabólicos en los entornos de la enfermedad son objeto de una intensa investigación, ya que pueden contribuir a la patogénesis.
El metabolismo energético en los tipos de células esqueléticas está relativamente poco estudiado, pero ha ganado atención en los últimos años7. Trabajos previos han demostrado que la glucólisis aeróbica es la vía de energía dominante en los osteoblastos calvariales, mientras que la oxidación de la glucosa a través del ciclo TCA juega un papel en la formación de osteoclastos 8,9. Otros han proporcionado evidencia de ácidos grasos como fuente de energía para los osteoblastos10. También se ha demostrado que el catabolismo de glutamina apoya la diferenciación osteoblástica de los progenitores11,12. Sin embargo, todavía falta una comprensión integral de la utilización del sustrato por varios tipos de células esqueléticas. Además, se espera que los cambios en el metabolismo celular durante la diferenciación celular o en respuesta a señales patológicas alteren la utilización del sustrato de combustible. A continuación se describe un protocolo fácil de usar para evaluar la oxidación del sustrato in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Used to filter BSA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociate cells from cell culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>PR MCT17 RB</td>
			<td>Used for reaction incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For Cell culture medium preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-Glucose</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042X050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC451050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C-oleate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC317050UC</td>
			<td>Used to make hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td>Used to flush marrow from long bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>70CELL</td>
			<td>Used to filter supernatant during cavarial digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td>CS2-0106</td>
			<td>Stains live cells to determine seed density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Ablumin</td>
			<td>Proliant Biologicals</td>
			<td>68700</td>
			<td>Used for fatty acid conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Determine the number of viable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
			<td>Used to pellet cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Dissociate cells from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom MEM alpha</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SKU: ME 18459P1</td>
			<td>Used to create custom hot media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g7528</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Traps CO2 during cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Supplemented for fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g3126</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A10490</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pecheney Plastic Packaging</td>
			<td>PM998</td>
			<td>Used to seal cell culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Prevents contamination in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244252</td>
			<td>Releases CO2 during metabolic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p5280</td>
			<td>Used to make custom media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
			<td>Determines radioactivity from the filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882453</td>
			<td>Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-1</td>
			<td>Reaction containers for scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Balance buffer for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>58045</td>
			<td>Traps CO2 during metaboilc assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>SC-215879</td>
			<td>BSA conjugated fatty acid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum filtration 1000</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99950</td>
			<td>Filter cMEM&#945;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing energy substrate oxidation in vitro with 14co2 trapping

Las mitocondrias albergan la maquinaria para el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la cadena de transporte de electrones (ETC), que generan trifosfato de adenosina (ATP) para mantener la homeostasis energética. La glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos son los principales sustratos energéticos que alimentan la respiración mitocondrial en la mayoría de las células somáticas. La evidencia muestra que los diferentes tipos de células pueden tener una clara preferencia por ciertos sustratos. Sin embargo, la utilización del sustrato por varias células en el esqueleto no se ha estudiado en detalle. Además, como el metabolismo celular está en sintonía con los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, las evaluaciones directas de la dependencia del sustrato en las células esqueléticas pueden proporcionar información importante sobre la patogénesis de las enfermedades óseas.
El siguiente protocolo se basa en el principio de liberación de dióxido de carbono de las moléculas de sustrato después de la fosforilación oxidativa. Mediante el uso de sustratos que contienen átomos de carbono marcados radiactivamente (14C), el método proporciona un ensayo sensible y fácil de usar para la tasa de oxidación del sustrato en el cultivo celular. Un estudio de caso con preosteoblastos calvariales primarios versus macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) demuestra una diferente utilización de los sustratos principales entre los dos tipos de células.

En este ejemplo, el método de captura de CO2 se utiliza para comparar la oxidación del sustrato por preosteoblastos calvariales primarios versus BMM, que se utilizan con frecuencia para la diferenciación in vitro de osteoblastos u osteoclastos, respectivamente. Después de que las células primarias se pasan y se cultivan en cMEMα durante la noche, generalmente alcanzan el 80-90% de la confluencia y exhiben su morfología característica. Los preosteoblastos calvariales son notablemente más grand...

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Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Este protocolo describe un método fácil de usar para examinar la oxidación del sustrato mediante el seguimiento de la producción de 14CO2 in vitro.

Evaluación de la oxidación del sustrato energético in vitro con 14capturas de CO2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

El uso de diferentes sustratos energéticos es tanto específico del tipo de célula como indicativo de la enfermedad. Medir el consumo de los sustratos específicos puede arrojar luz tanto sobre la biología normal como sobre la patología. La técnica no necesita equipo especializado y es fácil de escalar.También es más fácil de usar que los métodos publicados anteriormente. Comprender los cambios en la tasa de oxidación del sustrato permitirá el desarrollo de intervenciones dietéticas y farmacológicas para los trastornos metabólicos. Aunque se demuestra con tejido óseo, esta técnica se personaliza fácilmente para estudiar la flexibilidad metabólica en todos los tipos de células, proporcionando una comprensión de las causas y consecuencias de los cambios metabólicos.Después de sacrificar a los cachorros de tres a cinco días postnatales, transfiéralos a D PBS helado que contenga solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Exponga la calvaria extirpando la piel y los tejidos blandos. Recoja la región media cortando los tejidos circundantes de atrás hacia adelante en D PBS.Rasque las superficies internas y externas de la calvaria suavemente usando pinzas para ayudar a liberar las células en la digestión posterior. Prepare soluciones de 2 y 4 miligramos por mililitro de colagenasa tipo dos en D PBS y filtre cada solución con un filtro fresco de 0,22 micrómetros. Primero, digiera la calvaria limpia con dos miligramos por mililitro de solución de colagenasa durante 15 minutos, y luego deseche la solución de digestión.A continuación, digiera las muestras limpias en cuatro miligramos por mililitro de solución de colagenasa tres veces durante 15 minutos cada vez. Luego, tire de la solución de digestión y guárdela. Filtre la solución de digestión a través de coladores celulares de 70 micrómetros y centrífique el filtrado a 300 RCF durante cinco minutos.Vuelva a suspender el gránulo celular en medio alfa MEM completo que contenga 10% FBS y solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Cuente y selle las células en una placa de 10 centímetros. Cultive las células en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante tres días.Luego, disociar las células a 37 grados Celsius con 0.25 Tripsina EDTA. Después de la digestión, cuente y sembra las células en una placa de cultivo celular de 24 pocillos con un medio alfa MEM completo que contenga 10% FBS y solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Sembrar al menos cuatro pocillos por tipo de célula por sustrato, y al menos tres pocillos adicionales para cada tipo de célula para el conteo previo al ensayo.Cultive las células a 37 grados centígrados durante la noche. Después de extraer el músculo y el tejido conectivo de ratones de ocho semanas de edad y recolectar fémures y tibias, corte y descarte ambos extremos de los huesos con tijeras afiladas. Enjuague la médula ósea de un fémur y una tibia en una placa de Petri fresca de 10 centímetros con una jeringa equipada con una aguja de calibre 23 que contiene 15 mililitros de medio alfa MEM completo con solución antibiótica dual de estreptomicina de penicilina FBS al 10% y medio acondicionado 10% CGM 14 12.Cultive las células en la placa de Petri en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Después de tres días, deseche los medios de cultivo y enjuague las células con D PBS. Disociar las células unidas a 37 grados Celsius con 0.25% de Tripsina EDTA durante cinco minutos.Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet celular en el medio BMM. Contar y sembrar las células en una placa de cultivo celular de 24 pocillos según el procedimiento descrito anteriormente. Cultivo a 37 grados centígrados durante la noche en el medio BMM antes de comenzar los ensayos.Lave las células en los pocillos adicionales dos veces con D PBS. Disociar las células con 0,25%Tripsina EDTA. Suspender 20 microlitros de células digeridas en D PBS.Con 20 microlitros de solución de colorante de naranja acridina y yoduro de propidio, determine el número de células vivas con un contador celular automatizado y registre el número. Lave las células en los pocillos de ensayo dos veces con D PBS. Agregue 500 microlitros de medio caliente a cada ensayo bien en la campana de cultivo de tejidos designada RAM.Después de sellar la placa con parafilm, incube las células en una incubadora designada RAM a 37 grados Celsius durante 4 horas. Durante la incubación, corte el papel de filtro en trozos circulares, ligeramente más grandes que el área dentro de la tapa del tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e inserte el papel cómodamente en la tapa. Agregue 200 microlitros de un ácido perclórico de 1 molar a cada tubo y 20 microlitros de hidróxido de sodio al papel de filtro instalado dentro de la tapa.Después de incubar las células, transfiera 400 microlitros de medio de cultivo de cada pozo a los tubos preparados y cierre las tapas inmediatamente. Deje los tubos en un estante de tubos a temperatura ambiente durante una hora. Parallelae durante la incubación configura un vial de centelleo para cada tubo y lo llena con cuatro mililitros de líquido de centelleo.Transfiera cada trozo de papel de filtro a un vial de centelleo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Realice pruebas de limpieza en la campana de cultivo de tejidos, el baño de agua, el refrigerador, la incubadora, el fregadero, el suelo y cualquier otra área de trabajo para detectar una posible contaminación de RAM. Coloque las toallitas de papel en viales de centelleo que contengan líquido de centelleo.Mida la actividad de radio de carbono 14 en los viales de centelleo con un contador de centelleo y registre los resultados de lectura. Descontaminar el ambiente de trabajo, de acuerdo con las pautas de seguridad radiológica, si es necesario. La figura compara la oxidación del sustrato por calvaria primaria pre osteoblastos versus BMM.Después de que las células primarias se pasan y se cultivan en medio alfa MEM completo durante la noche, generalmente alcanzan una confluencia del 80 al 90% y exhiben su morfología característica. Los pre osteoblastos calvariales son notablemente más grandes que los BMM. Los resultados de la oxidación del sustrato mostraron que la tasa de oxidación para cada sustrato es significativamente mayor en los pre osteoblastos calvariales que en losBM, lo que probablemente indica una mayor producción de energía por fosforilación oxidativa en los pre osteoblastos.El tercer papel insertado debe ser ligeramente más grande que una tapa de tubo superior de 1,7 mililitros. Este método se puede utilizar junto con el consumo de oxígeno y para determinar la tasa general de fosforilación oxidativa y producción lactativa en las células. Este protocolo se puede utilizar para determinar el uso del sustrato durante distintas etapas de diferenciación o entornos de enfermedad.Con este conocimiento podemos desarrollar intervenciones para los trastornos metabólicos.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Investigación

Biología

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del Atlántico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Aplicación del movimiento pasivo de la cabeza para generar aceleraciones definidas en las cabezas de roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...