Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Vi takker NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 og ZIA NS003105-08) for at støtte dette arbejde.

BEMÆRK: Dyrebrugsproceduren fulgte NIH-retningslinjerne og blev godkendt af NIH Animal Care and Use Committee.
1. Bovin kromaffincellekultur
<ol><li>Forbered Lockes opløsning (tabel 1) og autoklaveværktøjer 1 dag før kromaffincellekultur.</li>
	<li>Få kvæg binyrerne fra et lokalt slagteri på kulturdagen, og hold dem nedsænket i iskold Lockes opløsning før dissektion. BEMÆRK: Binyrerne er fra 21-27 måneder gamle, sunde, sorte Angus af begge k?...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

En konfokal mikroskopisk billeddannelsesmetode er beskrevet for at detektere dynamikken i fusionspore og transmitterfrigivelse samt tre fusionstilstande, tæt fusion, opholdsfusion og krympefusion i bovin adrenalchromffinceller 4,24. En elektrofysiologisk metode til at depolarisere cellen og derved fremkalde exo- og endocytose er beskrevet. Systematisk konfokal billedbehandling giver information om forskellige former for poreadfærd for fusions- og fissionshænde...

Membranfusion formidler mange biologiske funktioner, herunder synaptisk transmission, blodsukkerhomeostase, immunrespons og viral indgang 1,2,3. Exocytose, der involverer vesikelfusion ved plasmamembranen, frigiver neurotransmittere og hormoner for at opnå mange vigtige funktioner, såsom neuronale netværksaktiviteter. Fusion åbner en pore for at frigive vesikulært indhold, hvorefter poren kan lukke for at hente fusionsvesikel, som kaldes kiss-and-run 1,4. Både irreversibel og reversibel fusionsporeåbning kan måles med celletilsluttede kapacitansoptagelser kombineret med fusionsporekonduktansoptagelser af enkelt vesikelfusion.
Dette fortolkes ofte som udtryk for fuldkollapsfusion, der involverer udvidelse af fusionen indtil udfladning af smelteversilen, og kys-og-løb, der involverer fusionsporeåbning og lukning, henholdsvis 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Nylige konfokale og stimulerede emissionsudtømning (STED) billeddannelsesundersøgelser i kromaffinceller observerede direkte fusionsporeåbning og lukning (kiss-and-run, også kaldet tæt fusion), fusionsporeåbning, der opretholder en Ω form med en åben pore i lang tid, betegnet opholdsfusion og krympning af fusionsveklen, indtil den er fuldstændig fusioneret med plasmamembranen, som erstatter fuldkollapsfusionsfusion til fusion af vesikler med plasmamembranen4, 8,14,15,16,17.
I neuroner er fusionsporeåbning og -lukning blevet detekteret med billeddannelse, der viser frigivelsen af kvanteprikker forudindlæst i vesikler, der er større end fusionsporen, og med fusionsporekonduktansmålinger ved frigivelsesfladen af nerveterminaler 5,18,19. Adrenal kromaffinceller anvendes i vid udstrækning som en model til undersøgelse af exo- og endocytose20,21. Selvom kromaffinceller indeholder store tætte kernevesikler, mens synapser indeholder små synaptiske vesikler, er exocytose- og endocytoseproteinerne i kromaffinceller og synapser ret analoge 10,11,12,20,21,22,23.
Her beskrives en metode til måling af disse tre fusionstilstande ved hjælp af en konfokal billeddannelsesmetode kombineret med elektrofysiologi i bovin adrenalkromaffinceller (figur 1). Denne metode involverer indlæsning af fluorescerende falske neurotransmittere (FFN511) i vesikler for at detektere exocytose; tilsætning af Atto 655 (A655) i badeopløsningen for at fylde den fusionsgenererede Ω-formprofil og mærkning af plasmamembranen med PH-domænet for phospholipase C δ (PH), som binder til PtdIns (4,5) P2 ved plasmamembranen 8,15,24. Fusionsporedynamik kan detekteres gennem ændringer i forskellige fluorescerende intensiteter. Selvom det er beskrevet for chromaffinceller, kan princippet om denne metode, der er beskrevet her, anvendes bredt på mange sekretoriske celler langt ud over kromaffinceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

Dynamisk fusion pore åbning og lukning medierer exocytose og endocytose og bestemmer deres kinetik. Her demonstreres det i detaljer, hvordan konfokal mikroskopi blev brugt i kombination med patch-clamp-optagelse til at detektere tre fusionstilstande i primære dyrkningskrumbarkhormonceller. De tre fusionstilstande omfatter 1) tæt fusion (også kaldet kiss-and-run), der involverer fusionsporeåbning og lukning, 2) opholdsfusion, der involverer fusionsporeåbning og vedligeholdelse af den åbne pore, og 3) krympefusion, der involverer krympning af den fusionsgenererede Ω-formprofil, indtil den smelter helt sammen ved plasmamembranen.
For at detektere disse fusionstilstande blev plasmamembranen mærket ved overekspression af mNeonGreen fastgjort med PH-domænet for phospholipase C δ (PH-mNG), som binder til phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PtdIns (4,5) P2) ved plasmamembranens cytosolvendte folder; vesikler blev fyldt med den fluorescerende falske neurotransmitter FFN511 for at detektere frigivelse af vesikulært indhold; og Atto 655 blev inkluderet i badeopløsningen for at detektere fusionsporelukning. Disse tre fluorescerende sonder blev afbildet samtidigt ved ~ 20-90 ms pr. Ramme i levende kromaffinceller for at detektere fusionsporeåbning, indholdsfrigivelse, fusionsporelukning og fusion af vesikelstørrelsesændringer. Analysemetoden er beskrevet for at skelne mellem tre fusionstilstande og disse fluorescensmålinger. Metoden beskrevet her kan i princippet gælde for mange sekretoriske celler ud over kromaffinceller.

Efter de eksperimentelle procedurer vist i figur 1 og figur 2 blev chromaffinceller fra kvæg binyrerne transficeret med PH-mNG for at mærke plasmamembranen; A655 blev tilføjet til badeopløsningen for at detektere lukning af fusionsporer; og fluorescerende falsk neurotransmitter FFN511 blev indlæst i vesikler til påvisning af frigivelse. Dernæst blev XY-plan konfokal timelapse billeddannelse af FFN511, PH-mNG og A655 udført hver 20-90 ms i cellebunden (Z-...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Denne protokol beskriver en konfokal billeddannelsesteknik til påvisning af tre fusionstilstande i bovin adrenal kromaffinceller. Disse fusionstilstande omfatter 1) tæt fusion (også kaldet kiss-and-run), der involverer fusionsporeåbning og lukning, 2) opholdsfusion, der involverer fusionsporeåbning og vedligeholdelse af den åbne pore, og 3) krympefusion, der involverer smeltet vesikelkrympning.

Konfokal mikroskopi til måling af tre tilstande af fusionsporedynamik i binyrekromaffinceller

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Membranfusion medierer mange biologiske funktioner. Denne protokol beskriver en metode til at detektere fusionsporeåbning og transmitterfrigivelsesdynamik og skelne mellem tre fusionstilstande; tæt fusion, opholdsfusion og krympefusion. Kombinationen af konfokalt mikroskop og patch-clamp-optagelsen letter visualisering af fusionsporeåbning og lukning og bestemmelse af deres kinetik.Selvom det er beskrevet for chromaffinceller, kan princippet om den her beskrevne metode anvendes bredt på mange sekretoriske celler langt ud over kromaffinceller. En vellykket implementering af denne metode afhænger af flere generelle trin, såsom generering af sund primær kromaffincellekultur, tilstrækkelig plasmidtransfektionseffektivitet og høj elektrofysiologisk optagelsessuccesrate. Vælg tre intakte kirtler uden udskæringer eller blødninger på overfladen, og fjern fedtvævet med en saks.Vask kirtlerne ved perfusion med Lockes opløsning, indtil der ikke kommer blod ud. Til fordøjelse injiceres enzymopløsningen gennem binyrevenen ved hjælp af en 30 millimeter sprøjte fastgjort med et 0,22 mikrometer filter, indtil kirtlen begynder at svulme. Lad derefter kirtlerne stå ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Injicer igen og lad kirtlerne være ved 37 grader Celsius i yderligere 10 minutter. Efter fordøjelsen skæres kirtlen i længderetningen fra binyrevenen til den anden ende med en saks for at udfolde kirtlen. Isoler den hvide medulla ved at pincet den ud i stykker i en 10 centimeter petriskål indeholdende Lockes opløsning.Klip og hak medulla med en saks. Medullaophænget filtreres med et nylonnet på 80 til 100 mikrometer i et bægerglas. Filtratet overføres til et 50 ml konisk rør og centrifugeres ved 48 x g stuetemperatur i tre minutter med en deceleration på tre.Efter centrifugering fjernes supernatanten, og cellepelleten resuspenderes med Lockes opløsning ved pipettering. Cellesuspensionen filtreres med en sil på 80 til 100 mikrometer, og centrifugeres ved 48 x g stuetemperatur i tre minutter med deceleration tre. Fjern supernatanten og resuspend cellepillen med 30 ml kulturmedium.Bestem cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometertællingskammer. Overfør 2.800.000 celler til et 15 ml rør. Pellet cellerne ved centrifugering ved 48 x g i to minutter med deceleration af tre.Der tilsættes 100 mikroliter transsektionsbuffer leveret af producenten til cellepillen. Og tilsæt derefter to mikrogram PH-mNG plasmid. Bland forsigtigt suspensionen ved at røre opløsningen op og ned og overfør blandingen til en elektroporationskuvette uden forsinkelse.Overfør straks kuvetten til elektroporatoren, vælg 005-programmet på skærmlisten, og tryk på Enter for at udføre elektroporation. Efter elektroporation tilsættes straks 1,8 ml medium til kuvetten og blandes forsigtigt med en mikropipette udstyret med en steril spids. Der tilsættes 300 mikroliter af suspensionen af de elektroporerede celler på dækslippen i hver skål, der pletterer fem til seks retter i alt til en elektroporationsreaktion.Overfør forsigtigt opvasken til en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius med 9% kuldioxid i 30 minutter og tilsæt forsigtigt to milliliter forvarmet medium til hver skål efter 30 minutter. Forbered plasterpipetter fra borosilikatglaskapillærer ved at trække dem med en pipettetrækker, belægge deres spidser med flydende voks og polere dem med en mikroforge. Tænd for patch clamp-optageforstærkeren, og start softwaren.Indstil softwarens passende calciumstrøm og kapacitansregistreringsparametre. Indstil en optagelsesprotokol på i alt 60 sekunders varighed, hvor stimuleringen starter efter 10 sekunder. Indstil holdepotentialet for spændingsklemmeoptagelse til 80 millivolt.Indstil en depolarisering på et sekund fra minus 80 millivolt til 10 millivolt som stimulus for at inducere calciumtilstrømning og kapacitansspring. Tænd for det konfokale mikroskopsystem og indstil de relevante parametre i softwaren. Tænd for laserne, inklusive 458 nanometer, 514 nanometer og 633 nanometer, og indstil emissionsopsamlingsområdet for hver laser i henhold til hver fluorescenssonde.Vælg en skål med god celletilstand og korrekt udtryk, og tilsæt to mikroliter af fluorescens falsk neurotransmitter FFN511 i mediet i skålen. Sæt skålen tilbage i inkubatoren i 20 minutter. Efter indlæsning af FFN511 forberedes optagekammeret og to mikroliter fluorescensfarvestof A655 tilsættes til 50 mikroliter badeopløsning.Overfør dækslet fra fadet til optagekammeret med en pincet, og tilsæt straks den A655 indeholdende badeopløsning. Placer en dråbe olie på 100X oliesænkningsmålet. Monter kammeret i mikroskopet, og brug justeringsknappen til at få olien til bare at komme i kontakt med bunden af dækslet.Bring cellerne i fokus og brug lysfelt og konfokal billeddannelse til at finde en passende celle med mNG-ekspression. Zoom ind på den valgte celle, og centrer den i synsfeltet, hvilket minimerer tomme områder. Indstil parametre for XY-plan konfokal billeddannelse ved et fast Z-plan af FFN511, PH-mNG og A665 med et minimeret tidsinterval.Juster fokus til bunden af cellen med en finjusteringsknap. Juster excitationslasereffekten i softwaren for at finde en indstilling for at få det bedste signal-støj-forhold og undgå betydelig fluorescensblegning. Tilsæt ni mikroliter intern opløsning i en patchpipette, og fastgør pipetten til holderen af patchklemmeforstærkertrinnet.Påfør en lille mængde positivt tryk med en sprøjte og flyt pipettespidsen for at røre badeopløsningen med en mikromanipulator. Sørg for, at forstærkeren viser, at pipettemodstanden er ca. mellem to og fire megaohms med en spændingsimpulstest. Tryk på LJ/Auto for at annullere væskekrydset.Flyt pipetten mod den valgte celle med en mikromanipulator. For at danne en celletilsluttet tilstand skal du flytte pipettespidsen for at røre ved cellen. Skift holdepotentialet fra nul til minus 80 millivolt, mens du anvender et blidt undertryk med en sprøjte.Når modstanden passerer en gigaohm, skal du vente i ca. 30 sekunder på, at konfigurationen stabiliseres. Tryk på C-fast/Auto for at kompensere for hurtig kapacitans. For at danne en engrostilstand skal du anvende korte, men kraftige impulser af undertryk med sprøjten, indtil membranen brister.Tryk på C-slow/Auto for at kompensere for langsom kapacitans. Juster billedfokus lidt for at fokusere på cellebunden. Start den konfokale time lapse-billeddannelse og patch-klemmeoptagelse samtidigt ved at klikke på Start-knapperne med to forskellige softwareapplikationer.Efter optagelse skal du sikre dig, at dataene gemmes. Skift holdepotentialet tilbage til nul millivolt. Flyt pipetten ud af badeopløsningen, og kassér den.Åbn raw imaging-filerne hos enhver producent eller medfølgende software. Gå til Proces, klik på ProcessTools og brug værktøjerne til at generere rullende gennemsnitlige filer for hvert time lapse-billede. Gem disse filer.Under kvantificer skal du gå til Værktøjer og klikke på Stack Profile-knapperne for at kontrollere tidspunkter før og efter stimulering og identificere fluorescensændringer i hver kanal. Klik på knappen Tegn ellipse for at cirkulere regioner af interesse for fusionsbegivenheder. Højreklik på billedet, og klik gem RIE'er for at gemme.Klik på Åbn projekter for at finde den rå fil. Højreklik på billedet, og klik på Indlæs ROI'er for at indlæse ROI-filen i raw-billedfilen for at måle fluorescensintensiteten. Gå til Værktøjer, og klik på Sorter ROI'er i softwaren, og plot sporene for alle tre kanaler for hvert investeringsafkast.Klik på Rapportér for at gemme ROI-dataene, herunder digitale data og billedsporinger for hvert investeringsafkast, i en filmappe. Hele celle patch-clamp optagelse og anvendelse af et sekund depolarisering fra 80 til 10 millivolt blev udført for at fremkalde exo og endocytose. Den påførte depolarisering inducerede en indadgående calciumstrøm, et kapacitansspring, der indikerer exocytose og et kapacitanshenfald efter springet, hvilket indikerer endocytose.Med time lapse-billeddannelse i cellebunden blev fusionshændelser induceret af et sekunds depolariseringsprotokol indikeret som FFN-fald, der afspejler FFN511-frigivelse, ledsaget af FPH- og A655-spotfluorescensforøgelse, hvilket afspejler PH-mNG og A655-diffusion fra plasmamembranen og badopløsningen ind i fusionsvesikel. Figuren viser tæt fusion identificeret som F655-dæmpning, mens FPH opretholdt eller henfaldt med en forsinkelse. Figuren repræsenterer opholdsfusion detekteret ved tilstedeværelsen af både PH-mNG og A655 pletter.Figuren repræsenterer krympefusion detekteret som parallel FPH- og F655-henfald ledsaget af en parallel størrelsesreduktion af PH-mNG-stedet og A655-stedet Vellykket optagelse kræver generering af hele cellekonfigurationen med patch-clamp og billeddannelse i cellebunden med korrekt fluorescerende intensitet for hver kanal. Kombinationen af elektrofysiologi og superopløsningsmikroskopi beskrevet her er et værdifuldt værktøj til måling af fusionsporedynamik og neurokredsløb.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Metoder til Cell-attached kapacitansmålinger i Mus Adrenal chromaffinceller Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulære forbindelse: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og ændringer i Synaptic Protein Density Brug Konfokal Fluorescens mikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM og pH-følsomme GFP-prober til Evaluer Neurotransmitter Vesikel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastomaceller: Cell Imaging og Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokol til tredimensionel Konfokal Morfometrisk Analyse af Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-medieret Fusion af Single proteoliposomer med bundet understøttede dobbeltlag i en Mikrofluid Flow Cell Overvåget af Polariseret TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Analyse til måling af nukleocytoplasmisk transport i realtid inden for motor neuronlignende NSC-34 celler

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Tredimensionel navigationsstyret, tilbøjelig, enkeltposition, lateral lændehvirvel interbody fusionsteknik

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...